Exosomal Fat-Liver Axis in Non-Alcoholic Fatty Liver Disease: Function and Modulation

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Cirrhosis is associated with lower serological responses to COVID-19 vaccines in patients with chronic liver disease

Publication . Simão, André; Palma, Carolina; Izquierdo-Sanchez, Laura; Putignano, Antonella; Carvalho-Gomes, Angela; Posch, Andreas; Zanaga, Paola; Girleanu, Irina; Henrique, Mariana; Araújo, Carlos; Degre, Delphine; Gustot, Thierry; Sahuco, Iván; Spagnolo, Elia; Carvalhana, Sofia; Moura, Miguel; Fernandes, Diogo AE.; Banales, Jesus M.; Romero-Gomez, Manuel; Trifan, Anca; Russo, Francesco Paolo; Stauber, Rudolf; Berenguer, Marina; Moreno, Christophe; Gonçalves, João manuel braz; Cortez-Pinto, Helena; Castro, Rui E.

Background & aims: The response of patients with chronic liver disease (CLD) to COVID-19 vaccines remains unclear. Our aim was to assess the humoral immune response and efficacy of two-dose COVID-19 vaccines among patients with CLD of different aetiologies and disease stages. Methods: A total of 357 patients were recruited in clinical centres from six European countries, and 132 healthy volunteers served as controls. Serum IgG (nM), IgM (nM), and neutralising antibodies (%) against the Wuhan-Hu-1, B.1.617, and B.1.1.529 SARS-CoV-2 spike proteins were determined before vaccination (T0) and 14 days (T2) and 6 months (T3) after the second-dose vaccination. Patients fulfilling inclusion criteria at T2 (n = 212) were stratified into 'low' or 'high' responders according to IgG levels. Infection rates and severity were collected throughout the study. Results: Wuhan-Hu-1 IgG, IgM, and neutralisation levels significantly increased from T0 to T2 in patients vaccinated with BNT162b2 (70.3%), mRNA-1273 (18.9%), or ChAdOx1 (10.8%). In multivariate analysis, age, cirrhosis, and type of vaccine (ChAdOx1 > BNT162b2 > mRNA-1273) predicted 'low' humoral response, whereas viral hepatitis and antiviral therapy predicted 'high' humoral response. Compared with Wuhan-Hu-1, B.1.617 and, further, B.1.1.529 IgG levels were significantly lower at both T2 and T3. Compared with healthy individuals, patients with CLD presented with lower B.1.1.529 IgGs at T2 with no additional key differences. No major clinical or immune IgG parameters associated with SARS-CoV-2 infection rates or vaccine efficacy. Conclusions: Patients with CLD and cirrhosis exhibit lower immune responses to COVID-19 vaccination, irrespective of disease aetiology. The type of vaccine leads to different antibody responses that appear not to associate with distinct efficacy, although this needs validation in larger cohorts with a more balanced representation of all vaccines. Impact and implications: In patients with CLD vaccinated with two-dose vaccines, age, cirrhosis, and type of vaccine (Vaxzevria > Pfizer BioNTech > Moderna) predict a 'lower' humoral response, whereas viral hepatitis aetiology and prior antiviral therapy predict a 'higher' humoral response. This differential response appears not to associate with SARS-CoV-2 infection incidence or vaccine efficacy. However, compared with Wuhan-Hu-1, humoral immunity was lower for the Delta and Omicron variants, and all decreased after 6 months. As such, patients with CLD, particularly those older and with cirrhosis, should be prioritised for receiving booster doses and/or recently approved adapted vaccines.

2023Journal article

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Role of mitochondria-targeting miRNAs in non-alcoholic fatty liver disease

Publication . Simão, André Daniel Lopes; Castro, Rui Eduardo Mota; Rodrigues, Cecília Maria Pereira; Zorzano, António

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) comprises a range of liver lesions from simple steatosis to non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and remains a major cause of mortality when progressing to cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Although major risk factors relate with the metabolic syndrome, including cross-talk between the liver and the skeletal muscle, the biological mechanisms of disease are not entirely known. Therefore, a better understanding of NAFLD pathogenesis may help in finding novel targeted therapies for patients with liver damage. In that regard, we have shown that morbid obese patients with NAFLD exhibit increased microRNA-34a (miRNA/miR-34a) expression, p53 acetylation and apoptosis, as well as decreased Sirtuin-1 expression, in more severe disease stages, suggesting that miRNAs actively contribute to disease progression. In turn, further evidence also supports a role for mitochondrial dysfunction in NAFLD pathogenesis. In particular, mitochondrial fusion protein mitofusin 2 (Mfn2) is decreased in human NASH, with its liver-specific ablation in mice leading to a NASH-like phenotype. The main goal of the work presented in this thesis was to dissect the role of mitochondria-targeting miRNAs in human and experimental models of NAFLD, elucidating their functional role in disease progression and potential as therapeutic targets. First, we explored the role of miR-34a in skeletal muscle dysfunction associated to NASH development. Our results showed that miR-34a is activated in skeletal muscle of both human and experimental models of NASH, leading to inhibition of Sirtuin-1 and AMP-activated protein kinase (AMPK). This resulted in impairment of insulin signalling and dysfunctional mitochondrial dynamics, including abnormally downregulated levels of Mfn2. Further, functional studies established a direct association between miR-34a- and palmitic acid (PA)-induced muscle cell deregulation, with downstream AMPK activation being able to restore muscle homeostasis. Finally, muscle miR-34a expression and Mfn2 protein levels correlated with hallmarks of human NAFLD and its progression. We next sought to identify miRNAs directly targeting liver Mfn2, which we showed to be consistently downregulated in multiple, complementary diet-induced NAFLD mice models. miR-222-3p was identified and validated as a direct Mfn2-binding miRNA, in vitro. Strikingly, miR-222-3p inhibition in two complementary diet-induced NASH mice models led to significantly increased Mfn2 expression levels, paralleling decreased hepatic steatosis, inflammation, liver injury and oxidative stress. Finally, we evaluated expression levels of both miR-34a and miR-222-3p in the liver of a large cohort of NAFLD patients, which progressively increased with disease severity and, further, correlated with the grades of steatosis, lobular inflammation and fibrosis. Overall, our results highlight the key function of mitochondria-targeting miRNAs in metabolic syndrome-associated NAFLD. In particular, muscle miR-34a- and liver miR-222-3p-induced mitochondrial dysfunction, involving Mfn2 downregulation, appear amenable to effective therapeutic targeting. This is particularly relevant considering that both miR-34a and miR-222-3p associate to a worse disease prognosis in NAFLD patients

2019Doctoral thesis

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Targeting the adipose tissue to treat fatty liver: role of TGR5

Publication . Silva, Daniela Filipa da; Castro, Rui Eduardo Mota; Rodrigues, Cecília Maria Pereira

O fígado gordo não-alcoólico (FGNA) é uma condição cuja prevalência está a crescer globalmente e está a caminho de se tornar a principal causa de doença hepática crónica. De facto, é possível que se torne, também, uma das principais causas de transplantes hepáticos. Atualmente, estima-se que uma em cada quatro pessoas no mundo sofra de FGNA. Em termos da sua progressão, o FGNA está inicialmente associado à acumulação de gordura no fígado (esteatose), mas pode evoluir para características histológicas menos favoráveis, nomeadamente esteatohepatite não-alcoólica (EHNA), despoletada pela inflamação e associada ao desenvolvimento de fibrose. Numa fase mais avançada, pode também levar a um estadio de cirrose e, eventualmente, ao aparecimento de carcinoma hepatocelular. Além disso, a patogénese desta doença está intimamente ligada à resistência à insulina e à desregulação do normal funcionamento do tecido adiposo. Infelizmente, ainda não existem medidas terapêuticas eficazes que estejam aprovadas para o tratamento do FGNA. Desde modo, torna-se de extrema importância a descoberta e o estudo de opções de tratamento para esta patologia, já que também a prevalência da diabetes tipo 2 e da obesidade deverão aumentar nos próximos anos. Num estado de obesidade, a libertação de ácidos gordos e citoquinas pelo tecido adiposo branco encontra-se aumentada, principalmente quando a acumulação de gordura é potenciada no tecido adiposo visceral e quando a capacidade de “absorção” de ácidos gordos nos tecidos subcutâneos se esgota. Assim sendo, os ácidos gordos não acumulados no tecido adiposo podem causar danos no fígado, ao serem transportados pela veia porta até este órgão. No entanto, os adipócitos castanhos e bege, cuja formação tem lugar no tecido adiposo branco através de um processo denominado “browning”, estão a revolucionar a forma como o tecido adiposo é percecionado, uma vez que estas células tem a capacidade de transformar energia em calor, promovida pela proteína uncoupling protein 1 (UCP1), em vez de acumular gordura. Atualmente, existem vários estudos centrados na descoberta de fatores que consigam potenciar atividade dos adipócitos castanhos e a formação dos adipócitos beges; e também focados em perceber quais os mecanismos envolvidos. Neste contexto, foi demonstrado que os ácidos biliares parecem potenciar o funcionamento dos adipócitos castanhos e também o processo do “browning”, através da estimulação de recetores celulares, em particular o recetor Takeda G-protein coupled bile acid receptor (TGR5). O TGR5 é expresso em diferentes tipos celulares (p. e. adipócitos, macrófagos e enterócitos) mas pouco expresso em hepatócitos. A sua atividade pode ser promovida por ácidos biliares, com diferentes graus de atividade, mas também já surgiram agonistas sintetizados em laboratório. Para além de induzir o “browning”, a atividade do TGR5 também é reconhecida por melhorar a obesidade, diminuir a resistência à insulina, a esteatose e as respostas inflamatórias. Assim sendo, a atividade do TGR5 tem sido estudada como uma possível abordagem terapêutica para doenças metabólicas. Estudos recentes realçam o papel que as vesículas extracelulares (EVs) libertadas do tecido adiposo parecem exercer na perpetuação da obesidade, resistência à insulina e até no FGNA, ao serem internalizados pelos hepatócitos onde o seu conteúdo - lípidos, proteínas e microRNAs, entre outros, é libertado. De notar que, a origem e contexto em que surgem estas EVs podem ditar os seus efeitos funcionais noutros órgãos. Por exemplo, EVs com origem no tecido adiposo visceral poderão ser mais facilmente associadas a um efeito metabólico negativo quando introduzidas noutras células ou órgãos. Neste estudo, o objetivo global foi avaliar o papel funcional de EVs libertadas por adipócitos, na presença ou ausência de ativadores do TGR5, sobre células hepáticas num contexto de inflamação. Adipócitos 3T3-L1 diferenciados foram expostos a diferentes agonistas do TGR5, incluindo ácidos biliares. A ativação do TGR5 foi comprovada pelo aumento dos níveis de expressão da proteína de UCP1, bem como do próprio TGR5. Culturas enriquecidas em adipócitos diferenciados, usando a técnica Density-based separation followed by Replating of Enriched Adipocytes in Monolayer (DREAM), exibiram ativação de TGR5 ligeiramente aumentada. Em seguida, o meio de cultura das células onde se observou maiores níveis de ativação do TGR5 foram processados para isolamento de EVs. Em paralelo, hepatócitos humanos HepG2 foram tratados com LPS para induzir inflamação, confirmada pelo aumento da expressão de mediadores pro-inflamatórios, nomeadamente IL-8, IL-1β, TNF-α e CCL2. Por fim, a incubação de células HepG2 com EVs de adipócitos onde o TGR5 tinha sido ativado, uma hora antes da adição de LPS às culturas celulares, reduziu consideravelmente o aumento de citocinas inflamatórias em resposta a este estímulo inflamatório. O segundo objetivo foi usar ratinhos com deleção do TGR5 no tecido adiposo, alimentados com uma dieta indutora de FGNA, para avaliar em detalhe o papel da expressão e ativação do TGR5 no tecido adiposo, in vivo. Devido aos atrasos na obtenção dos ratinhos transgénicos a partir dos nossos colaboradores, assim como todas as outras restrições impostas pela pandemia da COVID-19, o modelo ainda não está concluído. No entanto, relatamos já as experiências de otimização inicial que foram realizadas, em particular a otimização da atividade Cre induzida por tamoxifeno e genotipagem. No geral, os nossos resultados sugerem que EVs de adipócitos com o TGR5 ativado contêm moléculas capazes de exercer uma função anti-inflamatória em hepatócitos. Resultados sobre o papel do TGR5 no tecido adiposo durante os diferentes estadios de FGNA, in vivo, serão críticos para estabelecer inequivocamente se a ativação do TGR5 no tecido adiposo comunica efeitos metabólicos ao fígado por meio da modulação do conteúdo de EVs. Uma vez que resultados recentes sugerem que os adipócitos podem regular o metabolismo por meio da libertação de exosomas contendo miRNAs, e uma vez que agonistas do TGR5 estão a ser avaliados em ensaios clínicos para o FGNA, os nossos resultados atuais e futuros poderão ter importantes implicações terapêuticas e elucidar circuitos de sinalização que integram alvos tangíveis para a prevenção, gestão e/ou tratamento da obesidade e FGNA.

2021-12-21Master thesis

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Targeting liver cell metabolism and function in non-alcoholic fatty liver disease

Publication . Islam, Tawhidul; Rodrigues, Cecília Maria Pereira; Castro, Rui Eduardo Mota; Prip-Buus, Carina

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) comprises a series of liver lesions ranging from simple steatosis to non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and is a major cause of chronic liver disease that may progress to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Despite the risk factors related with the metabolic syndrome, the mechanisms of disease are not entirely known. Further, several promising molecules with different mechanisms of action are currently in development to treat NASH, although reported efficacy to date has been limited. Therefore, a better understanding of NAFLD pathogenesis and strategies targeting diverse therapeutically responsive nodes should pave the way to find novel and sustainable treatments eagerly waited for disease management. In that regard, we have shown that receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), an indispensable component of necroptosis, is increased in liver samples of human and experimental NASH, resulting in deleterious disease phenotypes including development of hepatic tumorigenesis. Intriguingly, RIPK3 was also found to be a crucial regulator of lipid and mitochondrial energy homeostasis, a role that is yet to be further explored. In turn, as key regulators of hepatic metabolism, farnesoid X receptor (FXR) and G protein-coupled receptor 5 (TGR5) influence NAFLD pathogenesis. In this regard, INT-767, a dual FXR and TGR5 agonist, constitutes a promising therapeutic strategy. Similarly, miR-21 genetic ablation and concomitant use of obeticholic acid (OCA) strongly improved diet-induced NAFLD and NASH through targeting PPARα and FXR, respectively. This further justifies the therapeutic potential of simultaneously activating nuclear receptors and inhibiting miR-21, which points towards multiple targeting approaches that deserve further attention. The main goal of the work presented in this thesis was to elucidate the role of cell death linked to mitochondrial bioenergetic and metabolic function in human and experimental NAFLD and NASH, and to further evaluate the therapeutic relevance of multiple targeting approaches in the resolution of the disease. First, we explored the role of RIPK3 in mitochondrial bioenergetics and hepatic lipid metabolism. Our results showed decreased expression and activities of mitochondrial respiratory chain complexes, downregulation of key mitochondrial biogenesis and function meditators, namely PGC1α, NRF1, NRF2, TFAM and MFN2, as well as increased mitochondrial DNA damage in diet-induced NASH mice. In vitro, murine hepatocytes exposed to palmitic acid (PA) displayed significantly altered mitochondrial morphology, membrane potential and respiration capacity, resulting in higher mitochondrial reactive oxygen species overload. Interestinly, Ripk3 depletion reverted deleterious mitochondrial dysfunction and halted NASH phenotype both in vitro and in vivo. Functional studies in PA exposed cells established a link between RIPK3 and lipid droplet- associated perilipin 1 (PLIN1), which modulated lipid droplet metabolism. This RIPK3-driven altered lipid droplet metabolism was also observed in diet-induced NASH in mice, as well as in a large cohort of human NAFLD patients. We also sought to evaluate the therapeutic potential of FXR and TGR5 dual agonist INT-767 and inhibition of miR-21, alone or in combination, in a pre-clinical model of NASH. INT-767 and anti-miR-21 significantly diminished hepatic lipid accumulation, fibrosis and necroinflammation, while ameliorating lipid and cholesterol homeostasis. Both treatments were effective at improving dysregulated mitochondrial function and halting NASH-associated carcinogenesis, decreasing the formation of pre-neoplastic liver nodules. Noteworthy, the combination of both treatments afforded better protective effects than each strategy alone. Overall, the results of this thesis revealed a key function of RIPK3 in regulating mitochondrial bioenergetics and mitochondria-associated lipid homeostasis in lipid-loaded cells, diet-induced NASH in mice and NAFLD in patients, suggesting RIPK3 as an attractive therapeutic target that deserves further investigation. In addition, simultaneous targeting of more than one therapeutically responsive metabolic nodes of NASH pathogenesis could represent an effective therapeutic approach for better disease resolution. These results highlight the key role of liver cell mitochondrial metabolism in NAFLD and NASH, provide potential therapeutic targets and suggest possible translation into future applications.

2021-09Doctoral thesis

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Therapeutic targeting of microRNA-21 and bile acid-activated receptors in non-alcoholic fatty liver disease

Publication . Ignačáková, Helena; Castro, Rui Eduardo Mota; Rodrigues, Cecília Maria M.P.

O fígado gordo não-alcoólico (FGNA) é uma doença metabólica crónica, caracterizada pela acumulação excessiva de gordura no fígado, muitas vezes resultante de uma dieta rica em gorduras e calorias, e associando-se com a diabetes de tipo 2. Durante os últimos anos, a taxa de incidência do FGNA cresceu de forma significativa, atingindo um quarto da população mundial adulta em 2016, sendo expectável que esta tendência se mantenha. O FGNA é caracterizado pela presença de lesões hepáticas, desde a esteatose simples até à esteatohepatite não alcoólica (EHNA), podendo mesmo progredir para fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). Ainda que a patogénese da doença não seja bem conhecida, pensa-se que seja uma doença bastante complexa e multifatorial, influenciada por vários fatores, incluindo fatores genéticos, idade, sexo, e estilo de vida. É de notar que a doença se caracteriza por uma fase precoce assintomática e, por isso, o diagnóstico ocorre numa fase mais tardia. Apesar da reversibilidade da doença, não existem tratamentos pré-estabelecidos na prática clínica. Não obstante, durante os últimos anos, têm sido identificados vários mecanismos que desempenham um papel no desenvolvimento e na progressão do FGNA, sugerindo vários alvos possíveis para o diagnóstico e para a terapêutica. Os microRNAs são pequenos RNAs endógenos não codificantes que atuam como reguladores da tradução de vários genes. Foi já demonstrado que vários microRNAs se encontram desregulados nos doentes em diversos estadios do FGNA, evidenciando o seu papel potencial quer no diagnóstico quer na terapêutica. Vários grupos de investigação, incluindo o nosso, já demonstraram a ocorrência da regulação positiva do microRNA-21 (miR-21) no fígado, nos músculos e no soro de pacientes com FGNA. Os nossos estudos demonstraram que a regulação negativa do miR-21 em ratinhos alimentados com dietas deficientes em metionina e colina provocou uma redução significativa na ocorrência de fibrose hepática, esteatose, e inflamação. De forma semelhante, a deleção do miR-21 hepático resultou na prevenção da intolerância à glucose e da esteatose em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gorduras. Também foi demonstrado que a desregulação de recetores nucleares ativados por ácidos biliares, particularmente do recetor X dos farnesóides (FXR) e do recetor 5 acoplado a proteínas G (TGR5), desempenha um papel importante na patogénese do FGNA. Ratinhos com defiência no FXR alimentados com uma dieta rica em gorduras desenvolveram manifestações patológicas da EHNA, enquanto que ratinhos knockout da SHP-1, um alvo ajusante do FXR, não desenvolveram quaisquer manifestações clínicas de esteatose hepática. Além disso, o nosso grupo demonstrou também que a ativação do recetor FXR através de indução pelo ácido obeticólico em simultâneo com a inibição do miR-21 em ratinhos alimentados com uma dieta “fast-food” preveniu significativamente a progressão da doença, incluindo a restauração do metabolismo lipídico no fígado. Por outro lado, outros autores demonstraram que a ativação do TGR5 resulta num decréscimo da produção de citocinas pró-inflamatórias, na sobreexpressão do GLP-1 e numa melhoria da esteatose hepática e da sensibilidade à insulina. Nesse sentido, o INT-767, um agonista duplo dos recetores FXR e TGR5, tem vindo a ser investigado como um potencial agente terapêutico para o tratamento do FGNA. Em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gorduras, o INT-767 foi capaz de melhorar o metabolismo lipídico e da glucose, a sensibilidade à insulina, a aterosclerose e a resposta inflamatória. O objetivo principal deste trabalho foi elucidar se o silenciamento do miR-21, através do uso de um inibidor sintético especifico - antagomiR-21 -, e/ou a ativação dos recetores FXR e TGR5, usando o agonista duplo INT-767, demonstram um efeito curativo no tratamento do FGNA, prevenindo a progressão da doença. Ratinhos C57BI/6J com 3 semanas foram alimentados com uma dieta rica em gorduras e deficiente em colina (HFCD), ou com uma dieta controlo, durante 12 semanas. Após este período, os ratinhos demonstraram evidência de esteatose hepática. Neste ponto, os ratinhos foram injetados com o antagomiR-21 e/ou tiveram a sua dieta suplementada com o INT-767, durante 12 semanas adicionais. Às 24 semanas, os ratinhos foram sacrificados e os tecidos hepático e adiposo, assim como o soro, foram recolhidas e processados para a realização de testes histológicos, bioquímicos e moleculares. A expressão de proteínas e genes envolvidos em várias vias de sinalização do FGNA, assim como de vias ajusante dos recetores nucleares, foi avaliada através de técnicas de Western blot, ELISA, e qRT-PCR. Além disso, a expressão de uma seleção de genes envolvidos no cancro do fígado foi analisada através de técnicas de microarray por qRT-PCR . Os resultados obtidos demonstraram que o tratamento com o antagormiR-21 e o INT-767, de forma isolada ou simultânea, resultou numa melhoria das manifestações clínicas da doença do FGNA, induzidas pela dieta HFCD. Ambos os tratamentos, isolados e combinados, levaram a uma prevenção parcial do ganho de peso, normalização dos niveís séricos de enzimas relacionadas com dano hepático, e prevenção do desenvolvimento de características histopatológicas da doença. O tratamento com antagomiR-21 e/ou o INT-767 diminuiu significativamente a expressão do microRNA endógeno miR-21 no fígado. Em paralelo, observou-se um aumento da atividade dos recetores FXR e TGR5, demonstrado através da análise dos seus alvos ajusante SHP-1 e CYP7a1; e PKAc-α, respetivamente. É de notar que a expressão proteica de ambos os recetores FXR e TGR5 no fígado demonstrou ser positivamente regulada após os tratamentos, possivelmente como resultado da melhoria geral na saúde dos animais. O tratamento com o antagomiR-21 e o INT-767, tanto de forma isolada como em combinação, reverteu vásrias desregulações metabólicas relacionadas com o FGNA, agindo frequentemente em sinergia. A expressão hepática da PPARα, uma proteína que nosso grupo já demonstrou melhorar o FGNA, demonstrou ser regulada negativamente e de forma significativa em ratinhos não tratados, alimentados com uma dieta HFCD, e positivamente em ratinhos na dieta mas tratados com o antagomiR-21 e/ou o INT-767. Curiosamente, apesar de termos previamente demonstrado que a PPARα é um alvo do miR-21, esta proteína sofreu uma regulação positiva mais significativa após o tratamento com o INT-767. Além disso, o tratamento combinado demonstrou ter um efeito sinergístico. O FGF-21, um regulador da homeostase dos glicolipídos, muitas vezes estimulado pela PPARα, mostrou ser regulado positivamente, quer no soro quer no fígado, pelo tratamento com o INT-767, de forma isolada ou em combinação com o antagomiR-21. O tratamento com o antagomiR-21 e/ou INT-767 resultou ainda numa diminuição da desregulação mitocondrial, se bem que com efeitos sinergísticos reduzidos. É de notar que a expressão hepática do NRF2, uma proteína com papel inibidor da esteatose hepática, demonstrou manter-se inalterada em ratinhos alimentados com a dieta HFCD em comparação com os ratinhos na dieta controlo. Ainda assim, a expressão hepática do NRF2 aumentou significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou com o INT-767. A expressão da proteína mitofusina-2, uma proteína essencial à fusão mitocondrial, aumentou significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e o INT-767, quer de forma isolada ou combinada. Em paralelo, a expressão heática da DRP1, uma proteína essencial à fissão mitocondrial, diminuiu significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT767. Além disso, o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767 resgatou a regulação positiva da expressão hepática das proteínas apoptóticas caspase-2 e -3, induzida pela dieta HFCD, demonstrando um pequeno efeito sinergístico em ambos os casos. Também a via de sinalização da insulina foi afetada em ratinhos alimentados com a dieta HFCD, que exibiram aumento da fosforilação da proteína JNK, comparando com ratinhos na dieta controlo. Por sua vez, o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767 reduziiu os niveís de ativação do JNK. Os animais alimentados com a dieta HFCD exibiram ainda niveís reduzidos de fosforilação das proteínas IRS1 e Akt, comparando com os animais controlo, enquanto que os tratamentos com o antagomiR-21 e o INT-767, sozinhos ou em combinação, reverteram quase por completo a inativação destas proteínas. A análise da expressão génica de genes selecionados no tecido adiposo visceral correlacionou-se com os resultados previamente obtidos no tecido hepático. Em particular, a expressão da PPARα foi inibida em ratinhos alimentados com a dieta HFCD, comparando com os ratinhos na dieta controlo, mas resgatada após o tratamento com antagomiR-21 e/ou INT767. De forma semelhante, a expressão da SHP-1 e do TGR5 foi resgatada após o tratamento. A expressão da FABP4, normalmente aumentada em resposta à acumulação de lípidos, foi inibida significativamente por ambos os tratamentos. Finalmente, ratinhos alimentados com a dieta HFCD evidenciaram ainda a activação de vias de sinalização oncogénicas no fígado, cujo padrão de expressão foi aproximado dos ratinhos controlo após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767. No seu conjunto, os resultados obtidos nesta Tese demonstram que o antagomiR-21 e/ou o INT-767 revertem a desregulação hepática do metabolismo lipidico e da função mitocondrial, reduzindo simultâneamente o ambiente pró-inflamatório e a apoptose. O tecido adiposo visceral sofreu igualmente uma melhoria metabólica em ratinhos alimentados com a dieta HFCD mas tratados com uma ou ambas as estratégias terapêuticas em estudo. Além disso, ambos os tratamentos resultaram na regulação negativa de vários genes associados ao cancro do fígado. Em conclusão, o tratamento isolado com o INT-767 ou o antagomiR-21 previnem a progressão do FGNA. Além disso, o tratamento combinado foi mais eficiente no resgate das desregulações metabólicas e na prevenção da ativação de vias de sinalização oncogénicas, devendo por isso ser considerado como uma estratégia terapêutica putativa para o FGNA e o desenvolvimento de cancro associado ao FGNA.

2021-02-23Master thesis

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