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- Nanoplatform to modulate dendritic cells and tumor microenvironment against triple negative breast cancerPublication . Verdial, Mafalda Carvalho; Ferreira, Helena Isabel Fialho Florindo Roque; Moura, Liane Isabel FerreiraDe acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), o cancro da mama é o tipo de cancro mais comum em mulheres, representando 24,2% de todos os cancros. Representa a maior taxa de mortalidade, relacionada com cancro, nas mulheres. Adicionalmente, é o segundo tipo de cancro mais frequente, e a sua incidência mundial tem vindo a aumentar nos últimos anos. Anualmente, estima-se que mais de 2,1 milhões de mulheres são diagnosticadas com a doença e que mais de 627,000 acabam por padecer desta patologia. A OMS estima que até 2020 uma em cada oito mulheres será afetada por esta doença. A taxa de mortalidade varia entre os diferentes subtipos de cancro, sendo o cancro da mama triplo negativo (CMTN) o mais agressivo. O cancro da mama triplo negativo (CMTN), que representa cerca de 10-15% de todos os cancros da mama, é um subtipo molecular do cancro da mama caracterizado pela ausência de expressão dos recetores de estrogénio, progesterona e ausência da sobre expressão de HER2. É, normalmente, associado a piores prognósticos resultantes de metastização precoce (1 a 3 anos após o diagnóstico) para o cérebro, pulmões e fígado. Adicionalmente, é resistente à quimioterapia. É mais comum em mulheres jovens (abaixo dos 40 anos) especialmente de ascendência Africana, portadoras de mutações germinais do gene BRCA1. Os indivíduos diagnosticados com esta doença apresentam um mau prognóstico e falecem rapidamente quando comparado com outros subtipos de cancro da mama, o que se pode dever ao seu comportamento agressivo, mas também à não existência de uma terapia específica e direcionada. Contrariamente aos outros subtipos, doentes afetadas pelo CMTN não beneficiam de terapia hormonal ou direcionada para o HER2, devido à ausência destes biomarcadores, o que diminui significativamente as opções de tratamento e, por conseguinte, de recuperação. Assim, a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia, tanto individualmente como em combinação, são atualmente, as únicas opções terapêuticas disponíveis. A quimioterapia tem sido o tratamento mais frequentemente aplicado, no entanto, esta abordagem terapêutica está associada a uma resposta fraca por parte da maioria dos doentes, toxicidade e eventual desenvolvimento de resistência aos agentes quimioterapêuticos. Por estas razões, considera-se urgente o desenvolvimento de terapêuticas direcionadas para o CMTN. Novos conhecimentos relativos aos mecanismos moleculares da progressão da doença permitiram o desenvolvimento de novas terapias que têm como alvos biomarcadores específicos do CMTN. Estes representam componentes das cadeias de sinalização indispensáveis para o crescimento, sobrevivência, invasão e progressão do tumor. Consequentemente, existem inúmeras novas moléculas, tanto em monoterapia como em combinação, em ensaios clínicos em fase I, II e III. É de notar que algumas destas terapias já foram aprovadas para o tratamento de outros tipos de cancro, tanto pela US Food and Drug Administration (FDA) como pela Agência Europeia do Medicamento (AEM). Nos últimos anos, a imunoterapia tem vindo a ganhar reconhecimento como uma possível opção de tratamento para certos tipos de tumor, sendo que o CMTM é um destes potenciais candidatos. A imunoterapia passou de uma “terapia promissora” para uma realidade clínica já bem comprovada. Diversas opções imunoterapêuticas foram já aprovadas pelas agências reguladoras do medicamento norte-americana (FDA) e europeia (EMA), e muitos outros estão em ensaios clínicos, como monoterapia ou combinado com tratamentos convencionais ou outros agentes direcionados. Estas terapêuticas inovadoras, baseiam-se em respostas anti-tumorais desencadeadas pelo próprio sistema imunitário do doente, através da ativação de uma complexa rede de células imunitárias, tais como os linfócitos T efetores CD8+ e os linfócitos T auxiliares CD4+, mas também em respostas de memória que impeçam a formação de metástases e a disseminação da doença. Contrariamente aos outros subtipos de cancro da mama, o microambiente tumoral do CMTN apresenta uma grande infiltração de linfócitos T, o que aumenta a suscetibilidade dos pacientes com esta patologia para a imunoterapia. Existem dois tipos de imunoterapia que têm sido aplicados a pacientes com CMTN em ensaios clínicos, são eles: os moduladores de immune checkpoints e as vacinas anti tumorais. Os immune checkpoints são um conjunto de moléculas co-estimuladoras e co-inibitórias envolvidas na ativação de complexas vias de sinalização que previnem a ativação excessiva dos linfócitos T em condições normais. No ambiente tumoral, a expressão dos immune checkpoints está alterada, evitando a resposta imunitária anti-tumoral mediada pelos linfócitos T. Os anticorpos monoclonais (mAb) direcionados para estas moléculas permitem reverter a inibição da imunidade adquirida e, assim, contribuir para a sobrevivência dos pacientes. Um dos mAb em estudo em ensaios clínicos para o tratamento do CMTN é direcionado contra o OX40. O OX40 é um recetor co-estimulador expresso pelos linfócitos T, cuja ativação, induz a expansão e sobrevivência dos linfócitos T efetores e bloqueia a ação inibitória dos linfócitos T reguladores no microambiente tumoral. No entanto, apesar de resultados promissores, estes têm sido associados, em particular quando usados em regimes de monoterapia, a efeitos adversos graves e a baixas taxas de respostas prolongadas em doentes com cancro metastático, para além de haver uma grande variabilidade de respostas ao tratamento. As vacinas anti-tumorais apresentam-se, então, como uma alternativa possível. Contudo, até agora, foram incapazes de produzir melhorias clínicas evidentes em ensaios clínicos. Torna-se, assim, imperativo ultrapassar estes obstáculos associados a estas duas opções imunoterapêuticas quando usadas individualmente. A solução natural tem sido a terapêutica combinatória. Ao combinar dois ou mais agentes terapêuticos que possuem mecanismos de ação diferentes, mais células cancerígenas devem ser destruídas, melhorando assim a resposta geral dos doentes à terapêutica. Por conseguinte, este trabalho consistiu no desenvolvimento de uma nanovacina multifuncional com o objetivo de remodelar o microambiente tumoral tornando-o susceptível à resposta imunológica mediada por células como consequência da ativação do immune checkpoint OX40, e assim melhorar a resposta imunitária anti-tumoral. Com esse objetivo foram desenvolvidas nano-vacinas anti-tumorais baseadas em nanopartículas (NPs) biodegradáveis constituídas por uma matriz de ácido polilático (PLA), direcionadas para as células dendríticas (DCs) e para o microambiente tumoral. Para a indução de uma reposta anti-tumoral específica, este nanosistema incorporou o antigénio K-ras(LT) cuja expressão está aumentada no CMTN, ligandos dos recetores toll-like, nomeadamente CpG-ODN e Poly(I:C) para potenciar a resposta imunitária, juntamente com o siRNA direcionado contra o TGF-β, uma importante citocina imunossupressora. A matrix das NPs foi modificada com ácido hialurónico de forma a promover a ativação das DCs, mas também direcionar as NPs para o microambiente tumoral, aumentando o seu tropismo para o recetor CD44, o qual se encontra sobre-expresso nas células de CMTN. As NPs apresentaram um diâmetro hidrodinâmico médio de cerca de 200 nm, com um índice de polidispersão baixo, carga à superfície da NP próxima da neutralidade, e eficiência de encapsulação superior a 60%. As NPs foram extensivamente internalizadas pelas DCs e células de CMTN, sem afetar as suas viabilidades. Adicionalmente, as NPs induziram a ativação e maturação das DCs, aumentando significativamente a expressão de diferentes marcadores de superfície, e permitiram reduzir significativamente a expressão do TGF-β in vivo. Os murganhos inoculados com células de CMTN E0771 e tratados com a nanovacina combinada com o mAb anti-OX40 demonstraram uma notável remissão do tumor, com um aumento de sobrevivência geral, apresentando um volume de tumor mais de 2 vezes menor que o obtido pelos murganhos tratados com o mAb anti-OX40. A nanovacina permitiu remodelar o perfil imunológico dentro do microambiente tumoral, o que se correlacionou com o efeito antitumoral geral obtido neste esquema combinatório. Este estudo revelou a sinergia entre uma nano-vacina multifuncional e o mAb anti-OX40 no CMTN, fornecendo informações importantes para o estabelecimento de novos regimes de tratamento tendo em vista uma maior eficácia no controlo deste tumor. Além disso, este trabalho mostrou que as células do estroma tumoral são capazes de encapsular nanopartículas, tornando-as alvos promissores para o tratamento do cancro da mama.
- Das Políticas Públicas De Igualdade De Género Às Lideranças No Feminino - Um estudo aplicado ao Subsetor da Administração Pública CentralPublication . Inácio, Ana Cristina de Matos Azinheiro; Nogueira, Fernanda Maria Duarte; Câmara, Stella Bettencourt daEm Portugal as políticas da igualdade de género tiveram início com a instauração da República e foram retomadas numa perspetiva mais alargada após 1974. Não obstante a sua evolução, dados estatísticos continuam a alertar-nos para o fato da dimensão de género não se encontrar plenamente implementada na Administração Pública Central do Estado existindo mais homens do que mulheres a ocupar os cargos de direção superior neste subsetor. Atendendo, designadamente, que este subsetor tem um papel de primeira linha na implementação das políticas públicas, considerou-se da maior relevância estudar que fatores continuam a contribuir para a não paridade de género no que toca às lideranças. Estabelecemos, assim, como objetivo geral da presente dissertação, identificar e analisar que fatores, na perspetiva dos dirigentes superiores da Administração Pública Central, determinam a sub-representatividade das mulheres nesses cargos. Além de se revisitarem as principais políticas desenvolvidas e de se efetuar um enquadramento teórico em torno dos conceitos e dimensões teóricas em análise, desenvolveu-se uma estratégia de investigação em redor da aplicação de um inquérito por questionário a 105 dirigentes em cargos de direção superior que nos permitisse saber que fatores, explícitos e latentes, ainda subsistem, como entraves, à ascensão das mulheres. Para tal foi efetuada a análise descritiva dos dados, seguindo-se uma análise fatorial exploratória, com recurso ao programa estatístico SPSS, versão 25. Concluímos que, não obstante a implementação de políticas públicas de igualdade de género e da evolução da cultura social e organizacional, os obstáculos são ainda, em larga medida, justificados pelo fato dos homens reunirem melhores condições de progressão na carreira do que as mulheres, sendo detentores de maior disponibilidade de tempo que canalizam para o desenvolvimento habilitacional e profissional. As mulheres em desfavor da sua evolução profissional, continuam a canalizar muito do seu tempo para a família e tarefas domésticas.
- Association of Aquaporin-3, Aquaporin-7, NOS3 and CYBA polymorphisms with hypertensive disorders in womenPublication . da Silva, Inês Vieira; Santos, Ana Carolina; Matos, Andreia; Silva, Alda Pereira da; Soveral, Graça; Rebelo, Irene; Bicho, ManuelPreeclampsia (PE), a pregnancy disorder influenced by oxidative stress and hypoxia, affects the health of the mother and baby and is associated with an increased risk of future hypertension (HT). Aquaporins are a family of water channels, comprising members that also transport glycerol (aquaglyceroporins) and hydrogen peroxide (peroxiporins), key molecules for metabolic homeostasis and redox signaling. Here, we investigated the association of Aquaporin-3 (AQP3; rs2231231), Aquaporin-7 (AQP7; rs2989924), NOS3 (4B/A intron) and CYBA (rs4673) genetic polymorphisms with the development of hypertensive disorders by qPCR/PCR in a cohort of 150 normotensive (NT) women (N = 90) or with previous PE (N = 60) during pregnancy. Prospectively, women were reclassified 2-16 years after pregnancy as NT (N = 98) or hypertensive (N = 48) and the genetic associations were reevaluated. In addition, genetic associations were reevaluated and compared between normotensive and hypertensive (HT) subjects. We found that AQP3 rs2231231, an aquaglyceroporin/peroxiporin, is associated with the development of HT, whereas AQP7, NOS3 and CYBA polymorphism did not correlate with PE or future HT. Because AQP3 was associated with hypertension only after pregnancy, its role might be related to later risk factors of hypertension such as metabolic syndrome or oxidative stress.
- Immunogenicity in fabry disease: the role os enzyme replacement therapyPublication . Pedro, Célia Isabel dos Santos; Gonçalves, João Manuel BrazA doença de Fabry (DF) é uma doença de sobrecarga lisossomal (DAL) ligada ao cromossoma X causada por mutações no gene GLA que codifica a α-galactosidase A. Isto, leva a um acúmulo progressivo de globotriaosilceramida (GL-3, Gb3) em todos os tecidos do corpo. As manifestações cardíacas, renais e neurológicas são comuns e a esperança de vida é significativamente reduzida em relação à população em geral. O controle da DF envolve a administração de terapia de reposição enzimática intravenosa (TRE). Duas formas, agalsidase alfa e agalsidase beta, foram aprovadas em vários países e são geralmente bem toleradas. Embora a TRE tenha demonstrado melhorar a evolução do doente e o curso da doença, especialmente quando iniciada no início da doença, a infusão intravenosa das proteínas recombinantes pode desencadear uma resposta humoral imune, resultando em reações associadas à infusão (RAIs), e/ou o desenvolvimento de anticorpos antifármaco neutralizantes (ADAs), que parecem atenuar a eficácia da terapia em doentes, mediando a progressão da doença apesar da TRE 1-3. Anticorpos imunoglobulina (Ig) G têm sido frequentemente descritos em doentes com DF recebendo TRE. As respostas de IgG são relatadas numa proporção maior de doentes que recebem agalsidase beta do que em doentes que recebem agalsidase alfa. Os anticorpos IgE são menos comuns do que os anticorpos IgG e não foram observados em doentes recebendo agalsidase alfa. O impacto clínico do desenvolvimento de anticorpos IgG para TRE em doentes com DF permanece obscuro, devido à falta de dados e à acentuada heterogeneidade dos pacientes em termos de manifestações da doença e resposta à terapia 4. Outros estudos que examinam o desenvolvimento de anticorpos em doentes com DF e o potencial impacto de tais anticorpos na eficácia da TRE são necessários. O objetivo principal deste projeto é estudar a imunogenicidade de um conjunto de doentes com DF e verificar o impacto da imunogenicidade na eficácia e no perfil de segurança da TRE. Para isso, fizemos o screning de anticorpos IgG1, IgG4 e IgE contra as terapias agalsidase alfa e beta, pré e pós infusão da TRE, através ELISA; e dissociamos os IC associados da TRE e fizemos o screning de IgG libertados dos IC, através ELISA, para identificarmos os falsos negativos. Relacionamos os resultados obtidos com os dados de segurança, dados clínicos e funcionais cardíacos e renais do doentes, para verificarmos o impacto da presença de ADA contra agalsidase alfa e beta, na eficácia e segurança da TRE, o que nos permitirá, ainda, fazem uma correlação direta entre as duas terapias TRE, agalsidase alfa e beta. No nosso estudo verificamos que os anticorpos IgG1 foram os mais frequentemente observados contra ambas as terapias, agalsidase alfa e beta, seguidos pelos anticorpos IgG4 e por último os anticorpos IgE menos frequentes, mas também presentes em doentes tratados com terapia com agalsidase alfa e em mulheres, ao contrário de o que alguns estudos demonstram. À semelhança de outros estudos, um maior desenvolvimento de ADA foi observado em doentes tratados com terapia com agalsidase beta versus terapia com agalsidase alfa. E também maior desenvolvimento, e em maiores quantidades de ADA em homens versus mulheres. Ao comparar os níveis de anticorpos IgG e IgE contra ambas as terapias, observamos apenas diferenças estatisticamente significativas para a terapia com agalsidase beta. Em relação aos IC, foi observada a presença de IC no pré e pós-infusão, porém não houve diferenças estatisticamente significativas, possivelmente porque os 30 minutos após a infusão da TRE não foram suficientes para que ocorresse a produção de IC. No entanto, ao analisar as diferenças de sinal entre as amostras tratadas e não tratadas com ácido, verificamos que o tratamento com ácido permite a dissociação de AAA dos IC. Isso é de suma importância para a medição e caracterização da imunogenicidade e mostra a presença de IC estáveis entre a droga e os anticorpos com diferentes perfis de afinidade circulando no sangue. Devido ao fato de não nos ter sido possível aceder os dados de segurança e dados clínicos e funcionais cardíacos e renais dos doentes, não fomos capazes de aferir e correlacionar a presença de ADA contra agalsidase alfa e beta, na eficácia e segurança da TRE e com o aparecimento de RAIs.
- Desenvolvimento de embalagens ativas biodegradáveis antioxidantes e antimicrobianasPublication . Tordo, Tânia Alexandra Carvalho; Ribeiro, Maria Henriques Lourenço; Pimentel, MadalenaCada vez mais o planeta Terra sofre com a poluição causada pelo Homem. Atualmente, os plásticos são um grande problema ambiental, a sua durabilidade, flexibilidade e baixo custo tornaram-no muito utilizado a nível mundial nas mais variadas áreas e ao longo dos anos gerou-se uma grande acumulação deste material, no ambiente. A indústria alimentar é uma das responsáveis. Presentemente as embalagens alimentares são indispensáveis, para que os alimentos possam ser embalados e distribuídos ao longo das cadeias de abastecimento. O Parlamento Europeu aprovou, em 2019, restrições aos produtos de plástico descartáveis e proibiu a venda de plásticos de utilização única em toda a UE, a partir de 2021. É necessário o desenvolvimento de embalagens sustentáveis e biodegradáveis para alterar o rumo da história. As embalagens ativas poderão ser parte da solução, aumentando o tempo de prateleira, a segurança e a qualidade do alimento. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e otimização de fibras e filmes comestíveis com materiais de origem marinha, alginato e quitosano. Estes biopolímeros são classificados como GRAS pela FDA o que possibilita a formação de embalagens comestíveis e biodegradáveis, onde podem ainda ser adicionadas substâncias ativas antioxidantes e/ou antimicrobianas para preservação do produto alimentar. Desenvolveram-se fibras com incorporação de ácido ascórbico e spirulina, pelas suas características antioxidantes e testou-se o poder antimicrobiano do alginato e do quitosano em bactérias e levedura. Testou-se os filmes e revestimentos produzidos em maçãs gala. Do ponto de vista comercial, atribui-se preferência à utilização de filmes face à utilização de revestimentos. Os melhores resultados foram obtidos em maçãs com filmes de alginato de cálcio 2 % deixadas a 4 ºC e com a incorporação de spirulina 0,2 % e vitamina C 1 %. Confirmou-se as propriedades gelificantes e formadoras de fibras, consistentes e maleáveis, do alginato e observou-se a sua atividade antifúngica. Os ensaios com DPPH revelaram que os compostos antioxidantes utilizados permaneciam ativos dentro das fibras e observou-se a característica antifúngica e antimicrobiana do quitosano nas maçãs pulverizadas.
- Atividade antimicrobiana in vitro da ceftriaxona encapsulada em lipossomas contra estirpes clínicas isoladas de animais de companhia com diagnóstico de infeção do trato urinárioPublication . Diogo, Rita Alexandra Correia; Aguiar, Sandra Isabel Rodrigues de; Neves, Solange Judite Roque Coelho Alves GilAs infeções do trato urinário ocorrem de forma frequente, na prática clínica veterinária, sendo responsáveis pela utilização de antibióticos no seu tratamento. O recurso excessivo a estes fármacos, tanto na medicina veterinária como na medicina humana, tem levado ao desenvolvimento e aumento das resistências antimicrobianas. Como consequência, ocorreu uma diminuição dos antibióticos disponíveis e eficazes para o tratamento de infeções bacterianas, transformando-se numa problemática a nível global. Perante esta situação, têm sido desenvolvidas novas abordagens ao tratamento de infeções bacterianas, que se têm vindo a demonstrar eficazes e promissoras, sendo uma delas o encapsulamento de antibióticos em lipossomas. No presente estudo, foi avaliada e comparada a atividade antimicrobiana, in vitro, da ceftriaxona livre e encapsulada em lipossomas, contra 13 estirpes clínicas de animais de companhia hospitalizados na Unidade de Isolamento e Controlo Biológico com diagnóstico confirmado de infeção do trato urinário. A ceftriaxona foi encapsulada em lipossomas com propriedades fusogénicas e uma composição lipídica PC:DOPE:CHEMS (rácio molar 4:4:2), com uma eficácia de encapsulação de 6%. A atividade antimicrobiana, da ceftriaxona lipossomal e livre, foi avaliada através da determinação da concentração mínima inibitória, pelo método de microdiluição em placa. Os resultados obtidos demonstraram que o efeito antimicrobiano da ceftriaxona encapsulada foi inferior ao da ceftriaxona livre, tanto para as estirpes classificadas como suscetíveis como para as MDR. Embora a formulação lipossomal utilizada neste estudo tenha características fusogénicas, o que lhe permite uma melhor interação com as bactérias, a eficácia de encapsulação demonstrou-se baixa, o que pode explicar estes resultados. Em suma, a atividade antimicrobiana, in vitro, da formulação lipossomal não apresentou um desempenho superior, quando comparada com a formulação livre. Contudo, a formulação lipossomal com propriedades fusogénicas demonstrou efeito antibacteriano contra algumas estirpes. Como perspetiva futura, as características fusogénicas da formulação lipossomal devem ser preservadas, para que a interação entre lipossoma e bactéria se mantenha, mas será necessário aumentar a eficácia de encapsulação.
- Desenvolvimento de pães com incorporação de microalgasPublication . Pedro, Cecília Domingues; Nunes, Maria Cristiana Henriques; Raymundo, Anabela MoreiraAs microalgas contêm uma elevada quantidade de nutrientes, nomeadamente proteínas, polissacáridos, ácidos gordos polinsaturados e pigmentos (clorofilas e carotenoides). O principal objetivo deste trabalho foi o estudo do impacto da adição das microalgas Tetraselmis chuii e Chlorella vulgaris na aptidão tecnológica de pães de trigo. As microalgas utilizadas foram produzidas no âmbito do projeto Algae2Future1, sendo também utilizada Chlorella vulgaris comercial. Para estudar o impacto das microalgas prepararam-se pães com um nível de incorporação de microalga desidratada de 4% (m/m). Avaliou-se a textura, reologia e a cor das massas e os parâmetros de qualidade dos pães: textura, volume, aw, humidade e cor. A incorporação da Chlorella vulgaris provocou aumento da estruturação, pelo aumento do tempo de desenvolvimento da massa durante a mistura e da estabilidade da mesma, aumento da componente elástica na avaliação do comportamento reológico em regime oscilatório e pelo aumento da firmeza da massa e do miolo na Análise de Perfil de Textura. No caso da incorporação de Tetraselmis chuii, os pães não apresentaram alterações na textura em relação ao controlo, mas apresentaram uma cinética de envelhecimento mais lenta. Verificou-se uma destabilização na estrutura da massa, visível na reologia da massa fermentada. A adição das microalgas aumentou o pH das massas e aumentou a humidade do miolo, mas a atividade da água não sofreu alterações em relação ao controlo. A cor das massas e dos pães alterou-se significativamente, sendo percetível uma diferença evidente entre o controlo e as massas e pães com incorporação de microalgas. Os pães depois de cozidos apresentaram tonalidades verdes quer na crosta quer no miolo.
- Therapeutic targeting of microRNA-21 and bile acid-activated receptors in non-alcoholic fatty liver diseasePublication . Ignačáková, Helena; Castro, Rui Eduardo Mota; Rodrigues, Cecília Maria M.P.O fígado gordo não-alcoólico (FGNA) é uma doença metabólica crónica, caracterizada pela acumulação excessiva de gordura no fígado, muitas vezes resultante de uma dieta rica em gorduras e calorias, e associando-se com a diabetes de tipo 2. Durante os últimos anos, a taxa de incidência do FGNA cresceu de forma significativa, atingindo um quarto da população mundial adulta em 2016, sendo expectável que esta tendência se mantenha. O FGNA é caracterizado pela presença de lesões hepáticas, desde a esteatose simples até à esteatohepatite não alcoólica (EHNA), podendo mesmo progredir para fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). Ainda que a patogénese da doença não seja bem conhecida, pensa-se que seja uma doença bastante complexa e multifatorial, influenciada por vários fatores, incluindo fatores genéticos, idade, sexo, e estilo de vida. É de notar que a doença se caracteriza por uma fase precoce assintomática e, por isso, o diagnóstico ocorre numa fase mais tardia. Apesar da reversibilidade da doença, não existem tratamentos pré-estabelecidos na prática clínica. Não obstante, durante os últimos anos, têm sido identificados vários mecanismos que desempenham um papel no desenvolvimento e na progressão do FGNA, sugerindo vários alvos possíveis para o diagnóstico e para a terapêutica. Os microRNAs são pequenos RNAs endógenos não codificantes que atuam como reguladores da tradução de vários genes. Foi já demonstrado que vários microRNAs se encontram desregulados nos doentes em diversos estadios do FGNA, evidenciando o seu papel potencial quer no diagnóstico quer na terapêutica. Vários grupos de investigação, incluindo o nosso, já demonstraram a ocorrência da regulação positiva do microRNA-21 (miR-21) no fígado, nos músculos e no soro de pacientes com FGNA. Os nossos estudos demonstraram que a regulação negativa do miR-21 em ratinhos alimentados com dietas deficientes em metionina e colina provocou uma redução significativa na ocorrência de fibrose hepática, esteatose, e inflamação. De forma semelhante, a deleção do miR-21 hepático resultou na prevenção da intolerância à glucose e da esteatose em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gorduras. Também foi demonstrado que a desregulação de recetores nucleares ativados por ácidos biliares, particularmente do recetor X dos farnesóides (FXR) e do recetor 5 acoplado a proteínas G (TGR5), desempenha um papel importante na patogénese do FGNA. Ratinhos com defiência no FXR alimentados com uma dieta rica em gorduras desenvolveram manifestações patológicas da EHNA, enquanto que ratinhos knockout da SHP-1, um alvo ajusante do FXR, não desenvolveram quaisquer manifestações clínicas de esteatose hepática. Além disso, o nosso grupo demonstrou também que a ativação do recetor FXR através de indução pelo ácido obeticólico em simultâneo com a inibição do miR-21 em ratinhos alimentados com uma dieta “fast-food” preveniu significativamente a progressão da doença, incluindo a restauração do metabolismo lipídico no fígado. Por outro lado, outros autores demonstraram que a ativação do TGR5 resulta num decréscimo da produção de citocinas pró-inflamatórias, na sobreexpressão do GLP-1 e numa melhoria da esteatose hepática e da sensibilidade à insulina. Nesse sentido, o INT-767, um agonista duplo dos recetores FXR e TGR5, tem vindo a ser investigado como um potencial agente terapêutico para o tratamento do FGNA. Em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gorduras, o INT-767 foi capaz de melhorar o metabolismo lipídico e da glucose, a sensibilidade à insulina, a aterosclerose e a resposta inflamatória. O objetivo principal deste trabalho foi elucidar se o silenciamento do miR-21, através do uso de um inibidor sintético especifico - antagomiR-21 -, e/ou a ativação dos recetores FXR e TGR5, usando o agonista duplo INT-767, demonstram um efeito curativo no tratamento do FGNA, prevenindo a progressão da doença. Ratinhos C57BI/6J com 3 semanas foram alimentados com uma dieta rica em gorduras e deficiente em colina (HFCD), ou com uma dieta controlo, durante 12 semanas. Após este período, os ratinhos demonstraram evidência de esteatose hepática. Neste ponto, os ratinhos foram injetados com o antagomiR-21 e/ou tiveram a sua dieta suplementada com o INT-767, durante 12 semanas adicionais. Às 24 semanas, os ratinhos foram sacrificados e os tecidos hepático e adiposo, assim como o soro, foram recolhidas e processados para a realização de testes histológicos, bioquímicos e moleculares. A expressão de proteínas e genes envolvidos em várias vias de sinalização do FGNA, assim como de vias ajusante dos recetores nucleares, foi avaliada através de técnicas de Western blot, ELISA, e qRT-PCR. Além disso, a expressão de uma seleção de genes envolvidos no cancro do fígado foi analisada através de técnicas de microarray por qRT-PCR . Os resultados obtidos demonstraram que o tratamento com o antagormiR-21 e o INT-767, de forma isolada ou simultânea, resultou numa melhoria das manifestações clínicas da doença do FGNA, induzidas pela dieta HFCD. Ambos os tratamentos, isolados e combinados, levaram a uma prevenção parcial do ganho de peso, normalização dos niveís séricos de enzimas relacionadas com dano hepático, e prevenção do desenvolvimento de características histopatológicas da doença. O tratamento com antagomiR-21 e/ou o INT-767 diminuiu significativamente a expressão do microRNA endógeno miR-21 no fígado. Em paralelo, observou-se um aumento da atividade dos recetores FXR e TGR5, demonstrado através da análise dos seus alvos ajusante SHP-1 e CYP7a1; e PKAc-α, respetivamente. É de notar que a expressão proteica de ambos os recetores FXR e TGR5 no fígado demonstrou ser positivamente regulada após os tratamentos, possivelmente como resultado da melhoria geral na saúde dos animais. O tratamento com o antagomiR-21 e o INT-767, tanto de forma isolada como em combinação, reverteu vásrias desregulações metabólicas relacionadas com o FGNA, agindo frequentemente em sinergia. A expressão hepática da PPARα, uma proteína que nosso grupo já demonstrou melhorar o FGNA, demonstrou ser regulada negativamente e de forma significativa em ratinhos não tratados, alimentados com uma dieta HFCD, e positivamente em ratinhos na dieta mas tratados com o antagomiR-21 e/ou o INT-767. Curiosamente, apesar de termos previamente demonstrado que a PPARα é um alvo do miR-21, esta proteína sofreu uma regulação positiva mais significativa após o tratamento com o INT-767. Além disso, o tratamento combinado demonstrou ter um efeito sinergístico. O FGF-21, um regulador da homeostase dos glicolipídos, muitas vezes estimulado pela PPARα, mostrou ser regulado positivamente, quer no soro quer no fígado, pelo tratamento com o INT-767, de forma isolada ou em combinação com o antagomiR-21. O tratamento com o antagomiR-21 e/ou INT-767 resultou ainda numa diminuição da desregulação mitocondrial, se bem que com efeitos sinergísticos reduzidos. É de notar que a expressão hepática do NRF2, uma proteína com papel inibidor da esteatose hepática, demonstrou manter-se inalterada em ratinhos alimentados com a dieta HFCD em comparação com os ratinhos na dieta controlo. Ainda assim, a expressão hepática do NRF2 aumentou significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou com o INT-767. A expressão da proteína mitofusina-2, uma proteína essencial à fusão mitocondrial, aumentou significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e o INT-767, quer de forma isolada ou combinada. Em paralelo, a expressão heática da DRP1, uma proteína essencial à fissão mitocondrial, diminuiu significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT767. Além disso, o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767 resgatou a regulação positiva da expressão hepática das proteínas apoptóticas caspase-2 e -3, induzida pela dieta HFCD, demonstrando um pequeno efeito sinergístico em ambos os casos. Também a via de sinalização da insulina foi afetada em ratinhos alimentados com a dieta HFCD, que exibiram aumento da fosforilação da proteína JNK, comparando com ratinhos na dieta controlo. Por sua vez, o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767 reduziiu os niveís de ativação do JNK. Os animais alimentados com a dieta HFCD exibiram ainda niveís reduzidos de fosforilação das proteínas IRS1 e Akt, comparando com os animais controlo, enquanto que os tratamentos com o antagomiR-21 e o INT-767, sozinhos ou em combinação, reverteram quase por completo a inativação destas proteínas. A análise da expressão génica de genes selecionados no tecido adiposo visceral correlacionou-se com os resultados previamente obtidos no tecido hepático. Em particular, a expressão da PPARα foi inibida em ratinhos alimentados com a dieta HFCD, comparando com os ratinhos na dieta controlo, mas resgatada após o tratamento com antagomiR-21 e/ou INT767. De forma semelhante, a expressão da SHP-1 e do TGR5 foi resgatada após o tratamento. A expressão da FABP4, normalmente aumentada em resposta à acumulação de lípidos, foi inibida significativamente por ambos os tratamentos. Finalmente, ratinhos alimentados com a dieta HFCD evidenciaram ainda a activação de vias de sinalização oncogénicas no fígado, cujo padrão de expressão foi aproximado dos ratinhos controlo após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767. No seu conjunto, os resultados obtidos nesta Tese demonstram que o antagomiR-21 e/ou o INT-767 revertem a desregulação hepática do metabolismo lipidico e da função mitocondrial, reduzindo simultâneamente o ambiente pró-inflamatório e a apoptose. O tecido adiposo visceral sofreu igualmente uma melhoria metabólica em ratinhos alimentados com a dieta HFCD mas tratados com uma ou ambas as estratégias terapêuticas em estudo. Além disso, ambos os tratamentos resultaram na regulação negativa de vários genes associados ao cancro do fígado. Em conclusão, o tratamento isolado com o INT-767 ou o antagomiR-21 previnem a progressão do FGNA. Além disso, o tratamento combinado foi mais eficiente no resgate das desregulações metabólicas e na prevenção da ativação de vias de sinalização oncogénicas, devendo por isso ser considerado como uma estratégia terapêutica putativa para o FGNA e o desenvolvimento de cancro associado ao FGNA.