Nanoplatform to modulate dendritic cells and tumor microenvironment against triple negative breast cancer

Verdial, Mafalda Carvalho

http://hdl.handle.net/10451/54400

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Authors

Verdial, Mafalda Carvalho

Advisor(s)

Ferreira, Helena Isabel Fialho Florindo Roque

Moura, Liane Isabel Ferreira

Abstract(s)

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), o cancro da mama é o tipo de cancro mais comum em mulheres, representando 24,2% de todos os cancros. Representa a maior taxa de mortalidade, relacionada com cancro, nas mulheres. Adicionalmente, é o segundo tipo de cancro mais frequente, e a sua incidência mundial tem vindo a aumentar nos últimos anos. Anualmente, estima-se que mais de 2,1 milhões de mulheres são diagnosticadas com a doença e que mais de 627,000 acabam por padecer desta patologia. A OMS estima que até 2020 uma em cada oito mulheres será afetada por esta doença. A taxa de mortalidade varia entre os diferentes subtipos de cancro, sendo o cancro da mama triplo negativo (CMTN) o mais agressivo. O cancro da mama triplo negativo (CMTN), que representa cerca de 10-15% de todos os cancros da mama, é um subtipo molecular do cancro da mama caracterizado pela ausência de expressão dos recetores de estrogénio, progesterona e ausência da sobre expressão de HER2. É, normalmente, associado a piores prognósticos resultantes de metastização precoce (1 a 3 anos após o diagnóstico) para o cérebro, pulmões e fígado. Adicionalmente, é resistente à quimioterapia. É mais comum em mulheres jovens (abaixo dos 40 anos) especialmente de ascendência Africana, portadoras de mutações germinais do gene BRCA1. Os indivíduos diagnosticados com esta doença apresentam um mau prognóstico e falecem rapidamente quando comparado com outros subtipos de cancro da mama, o que se pode dever ao seu comportamento agressivo, mas também à não existência de uma terapia específica e direcionada. Contrariamente aos outros subtipos, doentes afetadas pelo CMTN não beneficiam de terapia hormonal ou direcionada para o HER2, devido à ausência destes biomarcadores, o que diminui significativamente as opções de tratamento e, por conseguinte, de recuperação. Assim, a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia, tanto individualmente como em combinação, são atualmente, as únicas opções terapêuticas disponíveis. A quimioterapia tem sido o tratamento mais frequentemente aplicado, no entanto, esta abordagem terapêutica está associada a uma resposta fraca por parte da maioria dos doentes, toxicidade e eventual desenvolvimento de resistência aos agentes quimioterapêuticos. Por estas razões, considera-se urgente o desenvolvimento de terapêuticas direcionadas para o CMTN. Novos conhecimentos relativos aos mecanismos moleculares da progressão da doença permitiram o desenvolvimento de novas terapias que têm como alvos biomarcadores específicos do CMTN. Estes representam componentes das cadeias de sinalização indispensáveis para o crescimento, sobrevivência, invasão e progressão do tumor. Consequentemente, existem inúmeras novas moléculas, tanto em monoterapia como em combinação, em ensaios clínicos em fase I, II e III. É de notar que algumas destas terapias já foram aprovadas para o tratamento de outros tipos de cancro, tanto pela US Food and Drug Administration (FDA) como pela Agência Europeia do Medicamento (AEM). Nos últimos anos, a imunoterapia tem vindo a ganhar reconhecimento como uma possível opção de tratamento para certos tipos de tumor, sendo que o CMTM é um destes potenciais candidatos. A imunoterapia passou de uma “terapia promissora” para uma realidade clínica já bem comprovada. Diversas opções imunoterapêuticas foram já aprovadas pelas agências reguladoras do medicamento norte-americana (FDA) e europeia (EMA), e muitos outros estão em ensaios clínicos, como monoterapia ou combinado com tratamentos convencionais ou outros agentes direcionados. Estas terapêuticas inovadoras, baseiam-se em respostas anti-tumorais desencadeadas pelo próprio sistema imunitário do doente, através da ativação de uma complexa rede de células imunitárias, tais como os linfócitos T efetores CD8+ e os linfócitos T auxiliares CD4+, mas também em respostas de memória que impeçam a formação de metástases e a disseminação da doença. Contrariamente aos outros subtipos de cancro da mama, o microambiente tumoral do CMTN apresenta uma grande infiltração de linfócitos T, o que aumenta a suscetibilidade dos pacientes com esta patologia para a imunoterapia. Existem dois tipos de imunoterapia que têm sido aplicados a pacientes com CMTN em ensaios clínicos, são eles: os moduladores de immune checkpoints e as vacinas anti tumorais. Os immune checkpoints são um conjunto de moléculas co-estimuladoras e co-inibitórias envolvidas na ativação de complexas vias de sinalização que previnem a ativação excessiva dos linfócitos T em condições normais. No ambiente tumoral, a expressão dos immune checkpoints está alterada, evitando a resposta imunitária anti-tumoral mediada pelos linfócitos T. Os anticorpos monoclonais (mAb) direcionados para estas moléculas permitem reverter a inibição da imunidade adquirida e, assim, contribuir para a sobrevivência dos pacientes. Um dos mAb em estudo em ensaios clínicos para o tratamento do CMTN é direcionado contra o OX40. O OX40 é um recetor co-estimulador expresso pelos linfócitos T, cuja ativação, induz a expansão e sobrevivência dos linfócitos T efetores e bloqueia a ação inibitória dos linfócitos T reguladores no microambiente tumoral. No entanto, apesar de resultados promissores, estes têm sido associados, em particular quando usados em regimes de monoterapia, a efeitos adversos graves e a baixas taxas de respostas prolongadas em doentes com cancro metastático, para além de haver uma grande variabilidade de respostas ao tratamento. As vacinas anti-tumorais apresentam-se, então, como uma alternativa possível. Contudo, até agora, foram incapazes de produzir melhorias clínicas evidentes em ensaios clínicos. Torna-se, assim, imperativo ultrapassar estes obstáculos associados a estas duas opções imunoterapêuticas quando usadas individualmente. A solução natural tem sido a terapêutica combinatória. Ao combinar dois ou mais agentes terapêuticos que possuem mecanismos de ação diferentes, mais células cancerígenas devem ser destruídas, melhorando assim a resposta geral dos doentes à terapêutica. Por conseguinte, este trabalho consistiu no desenvolvimento de uma nanovacina multifuncional com o objetivo de remodelar o microambiente tumoral tornando-o susceptível à resposta imunológica mediada por células como consequência da ativação do immune checkpoint OX40, e assim melhorar a resposta imunitária anti-tumoral. Com esse objetivo foram desenvolvidas nano-vacinas anti-tumorais baseadas em nanopartículas (NPs) biodegradáveis constituídas por uma matriz de ácido polilático (PLA), direcionadas para as células dendríticas (DCs) e para o microambiente tumoral. Para a indução de uma reposta anti-tumoral específica, este nanosistema incorporou o antigénio K-ras(LT) cuja expressão está aumentada no CMTN, ligandos dos recetores toll-like, nomeadamente CpG-ODN e Poly(I:C) para potenciar a resposta imunitária, juntamente com o siRNA direcionado contra o TGF-β, uma importante citocina imunossupressora. A matrix das NPs foi modificada com ácido hialurónico de forma a promover a ativação das DCs, mas também direcionar as NPs para o microambiente tumoral, aumentando o seu tropismo para o recetor CD44, o qual se encontra sobre-expresso nas células de CMTN. As NPs apresentaram um diâmetro hidrodinâmico médio de cerca de 200 nm, com um índice de polidispersão baixo, carga à superfície da NP próxima da neutralidade, e eficiência de encapsulação superior a 60%. As NPs foram extensivamente internalizadas pelas DCs e células de CMTN, sem afetar as suas viabilidades. Adicionalmente, as NPs induziram a ativação e maturação das DCs, aumentando significativamente a expressão de diferentes marcadores de superfície, e permitiram reduzir significativamente a expressão do TGF-β in vivo. Os murganhos inoculados com células de CMTN E0771 e tratados com a nanovacina combinada com o mAb anti-OX40 demonstraram uma notável remissão do tumor, com um aumento de sobrevivência geral, apresentando um volume de tumor mais de 2 vezes menor que o obtido pelos murganhos tratados com o mAb anti-OX40. A nanovacina permitiu remodelar o perfil imunológico dentro do microambiente tumoral, o que se correlacionou com o efeito antitumoral geral obtido neste esquema combinatório. Este estudo revelou a sinergia entre uma nano-vacina multifuncional e o mAb anti-OX40 no CMTN, fornecendo informações importantes para o estabelecimento de novos regimes de tratamento tendo em vista uma maior eficácia no controlo deste tumor. Além disso, este trabalho mostrou que as células do estroma tumoral são capazes de encapsular nanopartículas, tornando-as alvos promissores para o tratamento do cancro da mama.

Triple-negative breast cancer (TNBC) is the most aggressive subtype of breast cancer. Immunotherapy, and most notably cancer vaccines and immune checkpoint modulators, has emerged as a promising alternative therapy. However, limited efficacy has been obtained for cancer vaccines and severe immune-mediated side effects have been related to immune checkpoint inhibitors under clinical development. Thus, to overcome the main disadvantages presented by these two therapeutic options when used individually, and considering the heterogeneity of TNBC, combination therapies are under clinical development to treat this specific breast cancer subtype. The main hypothesis is that the development of a multifunctional nanovaccine could re-shape the tumor microenvironment (TME), sensitizing TNBC to the immune checkpoint agonist OX40, and thus, improving the overall anti-tumor immune response. For this purpose, a poly(lactic acid) (PLA) nanoparticle (NP)-based nanovaccine was designed and synthesized to target dendritic cells (DC) and the TME by incorporating TNBC-associated antigens, toll-like receptor ligands CpG and Poly(I:C), and siRNA to downregulate the potent immunosuppressive cytokine transforming growth factor-β (TGF-β). NP matrix was modified by hyaluronic acid to promote DC activation, but also to potentiate their delivery to the TME by interacting with the CD44 receptor overexpressed in TNBC cells. NPs presented an average diameter close to 200 nm, displaying narrow polydispersity index, near-neutral surface charge, and entrapment efficiency (EE) superior to 60%. NPs were extensively taken up by both DC and TNBC cells. In addition, NPs induced DC activation and maturation, significantly increasing the expression of the DC activation and maturation surface markers. E0771 tumor-bearing animals treated with the multifunctional nanovaccine combined with αOX40 showed a noteworthy tumor remission, with a higher overall survival and a tumor volume more than 2-fold lower than those obtained for αOX40-treated mice. The nanovaccine re-shaped the immune profiling within the TME, which correlated with the overall anti-tumor effect obtained in this combinatorial scheme. This study revealed the synergy between a multi-targeting nanovaccine and αOX40 in TNBC, providing important insights for the establishment of novel combination regimens against this tumor. Moreover, this work showed that tumor stromal cells are able to entrap nanoparticles making them promising targets for cancer treatment.