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Discovery and development of new small-molecule immune system modulators

Publication . Acúrcio, Rita C; Guedes, Rita Alexandra do Nascimento Cardoso; Ferreira, Helena Isabel Fialho Florindo Roque; Salvador, Jorge António Ribeiro

Modulation of immune modulatory pathways has emerged as one of the most successful and explored approaches for cancer immunotherapy. Current therapeutics include monoclonal antibodies, which have shown impressive clinical outcomes in the treatment of several types of tumors. However, low response rate, patient acquired resistance and induction of severe immune-related adverse effects represent critical drawbacks. To overcome these limitations, complementary strategies that inhibit tumor immunosuppressive pathways and enhance immunity are urgently needed. We hypothesized that inhibition of PD-1/PD-L1 interaction, for immunosuppression blockade, could be improved by the development of immune modulatory small molecules. For this purpose, we developed a computer-assisted drug design approach that allowed the identification of potential PD-1/PD-L1 small-molecule inhibitors. These potential hits were confirmed as true hits by in vitro and ex vivo assessment of its antitumor immune response. The compounds identified were able to activate T cell function by increasing tumor-associated antigen recognition, processing and presentation to effector T cells. The use of computational-aided drug design tools was decisive to accelerate the identification of new immune small molecules modulators which, certainly, will play a key role in the next generation of cancer immunotherapy approaches. Hits were identified by a structure based virtual screening campaign based on molecular docking. In addition to hit discovery, these methods were essential in providing a strong structural elucidation. Over biochemical and in vitro studies three PD-1/PD-L1 small-molecule inhibitors by direct PD-L1-binding were identified at nanomolar scale. Two different types of cancer, a highly immunogenic (melanoma) and a traditionally non-responder to immune checkpoint modulation (breast cancer) were studied in vitro. Finally, co-culture experiments were developed and the treatment with the identified inhibitors led to T cell activation and antigen-specific cytotoxic T-cell activity against melanoma cells ex vivo. Altogether, these findings reveal important aspects on the use of small molecules as immune checkpoint modulators, as well as their effect on the modulation of tumor-infiltrating immune cells. This approach offers numerous advantages over the use of monoclonal antibodies, predominantly on pharmacokinetics properties. In addition, they represent a more affordable and accessible alternative. Therefore, small-molecule immune system modulators emerge as a potential strategy to improve clinical outcomes of cancer treatment.

2019-12Doctoral thesis

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Viral surface glycoproteins as potential drug targets against HIV-1 and HIV-2 infections

Publication . Serra, Patrícia Filipa Alves; Guedes, Rita Alexandra do Nascimento Cardoso; Taveira, Nuno Eduardo Moura dos Santos da Costa

AIDS (acquired immune deficiency syndrome) was discovered more than forty years ago, however, until now there is still no vaccine or cure for this disease. AIDS is caused by two human immunodeficiency virus (HIV) types, HIV-1 and HIV-2. HIV-1 is pandemic while HIV-2 is mainly confined to West Africa and western European countries (e. g., France, and Portugal). These two viruses share several common hallmarks, aside from a similar mode of transmission, similar intracellular replication mechanisms, and clinical consequences. In fact, as the disease progresses, people infected with HIV-2 will become vulnerable to the same spectrum of associated opportunistic infections and co-morbidities as people infected with HIV-1. Traditionally, HIV-2 infection is frequently neglected in global HIV/AIDS campaigns, however, a special emphasis must be given to HIV-2, which poses distinct challenges for prevention, diagnosis, and treatment to eradicate AIDS. None of the current drugs effectively prevents entry into the cells and the efficacy of the available drugs is very limited against HIV-2. HIV envelope glycoproteins mediate binding to the receptor CD4 and co-receptors at the surface of the target cell, enabling fusion with the cell membrane and viral entry. The discovery of multiple new hit compounds can be used as useful starting points towards drug candidates for HIV-1 and HIV-2 therapy. The viral gp120 and gp125 are critical for the recognition of receptors and allowing the internalization of viral content into the cell. Its modulation can lead to the disturbance of the entry viral mechanism. In the absence of a complete crystallographic structure of HIV-2 envelope gp125 comprising variable domains, computer-aided modulation is crucial to identify structural features in the variable regions that correlate with HIV-2 tropism and susceptibility. Here, we developed and optimized a computer-assisted drug design approach of an important HIV-2 glycoprotein that allows us to explore and gain further insights at the molecular level into protein structures and interactions crucial for HIV-2 inhibition. A 3D structure of HIV-2ROD gp125 was generated by a homology modelling campaign. To disclose the importance of the main structural features and compare with experimental results, 3D-models of six mutants were also generated. These mutations revealed selectively impact the behaviour of the protein. Furthermore, molecular dynamics simulations were performed to optimize the models, and the dynamic behavior was tackled into account for structure flexibility and interactions network formation. It is primordial to understand the structural behaviour of these domains inserted in the main structure. Structurally, the mutations studied lead to a loss of aromatic features, very important for the establishment of π-π interactions, which could induce a structural preference by a specific coreceptor. Additionally, a drug discovery protocol to identify small molecules that inhibit the attachment and binding of HIV with host cells mediated by the envelope surface glycoproteins was developed. The discovery protocol based on molecular docking and virtual screening was developed to gp120 of HIV-1 to disclose molecular characteristics of potential new inhibitors of the viral attachment that we want to correlate with the homologous modulated protein of HIV-2. Altogether, these findings reveal important aspects of the structural characterization of the glycoproteins fundamental to the viral entry mechanism of HIV. The computational approach offers numerous advantages to obtain these new insights into the structure-function relationship, and this translational methodology can lead to the improvement of the knowledge of viral glycoproteins and its application towards the battle against the HIV infection.

2021-01Doctoral thesis

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Small molecules for cancer immunotherapy: a melanoma approach

Publication . Serronha, Lara Inês Silva; Ferreira, Helena Isabel Fialho Florindo Roque; Guedes, Rita Alexandra do Nascimento Cardos

O cancro constitui um dos principais e maiores problemas de saúde, a nível mundial, e continua a ser urgente o desenvolvimento de abordagens terapêuticas mais seguras, mas também eficazes que permitam controlar os estados mais avançados desta doença. Apesar dos progressos feitos nos últimos anos, na prevenção, diagnóstico e tratamento, a sua incidência continua a aumentar, sendo uma das principais causas de mortalidade. De facto, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) estima-se que em 2030 se registem mais de 13 milhões de vítimas mortais. Em termos gerais, o cancro engloba um vasto conjunto de doenças caracterizado por uma proliferação celular anormal e descontrolada. No caso de ser um tumor maligno, este pode desenvolver a capacidade de invadir e danificar os tecidos e órgãos adjacentes, por via linfática, num processo denominado por metastização. De todos os cancros humanos, o cancro da pele é um dos mais frequentes, e apesar de constituir uma pequena fração das neoplasias cutâneas, o melanoma representa o tipo de cancro da pele mais agressivo e mortal. O melanoma maligno é um tumor consideravelmente heterogéneo que resulta da ação combinada de diversos fatores, incluindo genéticos, individuais, ambientais, entre outros, estando o seu prognóstico fortemente relacionado com o estado da doença quando diagnosticada. Para além da excisão cirúrgica, quando diagnosticado precocemente, outras opções terapêuticas incluem a quimioterapia (com os agentes Dacarbazina e Temozolomida) e radioterapia, no entanto nenhuma delas tem um potencial igualmente curativo e os resultados clínicos são limitados. O melanoma avançado, e na sua forma metastática, é altamente caraterizado pela resistência à maioria das terapias convencionais e a sua mortalidade aumenta por falta de outras opções eficazes de tratamento. Assim, as terapias têm vindo a evoluir a partir de estratégias relativamente inespecíficas, para abordagens mais direcionadas. A partir de 2011 doentes afetados pela forma disseminada desta doença passaram a poder usufruir de novos agentes terapêuticos direcionados para alvos específicos identificados como estando associados aos estados mais agressivos desta doença. Destacam-se a aprovação de inibidores de BRAF/MEK, e mais tarde, de moduladores de vias de sinalização associadas a immune checkpoints. A imunoterapia, em oncologia, tem como objetivo restaurar ou amplificar uma resposta imune anti-tumoral por parte do hospedeiro, através da activação de uma rede complexa de células, que inclui linfócitos CD8+ efectores e CD4+ auxiliares, linfócitos B, células natural killer (NK), células dendríticas (DC), entre outras, bem como a libertação de citocinas e mediadores inflamatórios por parte destas células efectoras. No entanto, o tumor tem a capacidade de utilizar mecanismos de supressão fisiológicos, para 9 escapar a uma resposta imunitária, e criar um microambiente tumoral que favorece a sua proliferação e crescimento. Entre outros, o aumento da expressão de moléculas de regulação da resposta imune, que inclui os recetores proteína 4 associada aos linfócitos T citotóxicos, CTLA- 4, e morte celular-programada 1, PD-1, como mecanismo de inibição da ativação dos linfócitos T, estão entre os mecanismos mais utilizados para bloquear a acitividade anti-tumoral do sistema imunitário. Desta forma, o desenvolvimento de terapias que inibam estas moléculas, conhecidas como “immune checkpoints”, afigura-se como promissor no combate a um crescente número de tumores. Mais especificamente, a aprovação de anticorpos monoclonais anti- PD-1/PD-L1, como o Pembrolizumab e Nivolumab, tem vindo a revolucionar as opções de tratamento para doentes com melanoma, tendo já demonstrado benefícios clínicos e aumento de respostas objetivas, quando comparados à quimioterapia tradicional. No entanto, o aparecimento de mecanismos de resistência primária ou adquirida, e a indução de efeitos adversos são alguns dos fatores que ainda limitam a sua utilização. Além disso, ainda que a combinação destes modeladores com outras abordagens terapêuticas tenha permitido melhorar alguns destes aspetos, apenas uma percentagem de doentes responde a estas terapêuticas combinadas, observando-se o desenvolvimento de resistências. Desta forma, torna-se urgente o desenvolvimento de alterativas imunoterapêuticas que permitam sensibilizar o microambiente tumoral de forma a que volte a ser susceptível à ação anti-tumoral destas abordagens atualmente tão clinicamente relevantes. Recentemente, a utilização de pequenas moléculas como inibidores de immune checkpoints tem vindo a receber maior atenção devido às vantagens que apresentam sobre os convencionais anticorpos monoclonais, nomeadamente: capacidade de atravessar várias barreiras fisiológicas e biológicas; maior permeabilidade celular e difusão no microambiente tumoral, especialmente no caso de tumores sólidos; melhoria no perfil farmacocinético e farmacodinâmico; diminuição dos efeitos adversos; menor custo de produção e possibilidade para administração oral, entre outras. Para além disto, o avanço na nanotecnologia e no desenvolvimento de nanoestruturas para “drug delivery” tem vindo a possibilitar a síntese de nanomateriais com diferentes características, dependendo da ação terapêutica pretendida, bem como das propriedades fisico-químicas das moléculas ativas que por eles serão transportadas. Assim, a incorporação destas pequenas moléculas imunomoduladoras, assim como antigénios tumorais e potenciadores de resposta imune, em nanopartículas (NP) biocompatíveis e biodegradáveis irá, não só, permitir uma entrega eficaz, segura, e não-tóxica, mas também, aumentar a sua acumulação específica no local de interesse. Para além disso, irá também permitir uma libertação controlada do composto10 melhorando ainda mais a já promissora abordagem da inibição de immune checkpoints com pequenas moléculas com actividade biológica. Para além disso, a capacidade de modificação das propriedades biofísicas (ex: tamanho, carga e morfologia) das NP permite obter nanoplataformas de entrega desenhadas tendo em vista a sua interação com os sistemas biológicos alvo, aumentando a eficácia desta abordagem terapêutica. Assim, o principal objectivo do trabalho aqui descrito foi desenvolver NP poliméricas de ácido poliláctico (PLA) capazes de incorporar uma pequena molécula anti-Ligando-1 do Recetor da Morte Celular Programada, PD-L1 e a avaliação do seu efeito em células imunes e tumorais. Para tal, o efeito da pequena molécula #56 anti PD-L1 livre ou incorporada nas NP na viabilidade celular foi avaliado em duas linhas celulares (células dendríticas JAWSII (ATCC® CRL-11904™), melanoma, B16F10 (ATCC® CRL-6475™)), que representam subpopulações que expressam níveis mais elevados de PD-L1 no microambiente tumoral altamente imunosupressor. Avaliou-se de igual forma o efeito desta pequena molécula, livre ou incorporada nas NP, na inibição do PD-L1 na linha celular de melanoma anteriormente referida. Sendo que a indução de uma resposta imunológica robusta com a estimulação de linfócitos T CD4+ e CD8+, depende também da apresentação eficaz de antigénios tumorais pelas DC, actualmente reconhecidas como entidades fundamentais na estimulação de uma resposta imune eficaz, foi preparada e caracterizada uma NP multivalente, tendo em vista o transporte de combinações da pequena molécula anti PD-L1, com péptidos antigénicos de melanoma (Melan-A/MART-1) e o imuno potenciador CpG, de forma a que o expectável efeito sinérgico resulte numa maior eficácia anti-tumoral. Os resultados aqui descritos demonstram que as NP desenvolvidas, utilizando os métodos de única ou dupla emulsão com evaporação de solvente, apresentaram as características ideais para os objectivos anteriormente descritos, com um diâmetro hidrodinâmico médio inferior a 200 nm, uma distribuição de tamanhos homogénea (PdI < 0.2) com carga superficial negativa inferior a -8 mV. Importa realçar também a estabilidade e reprodutibilidade das NP preparadas por ambos os métodos, em particular o de dupla emulsão, sendo os valores de desvio padrão, para qualquer uma das características físico químicas, mínimo. Para além disto, estas NP permitiram eficiências de encapsulação, EE (% (w/w), e capacidade de carga, LC (μg/mg), elevadas para qualquer uma das biomoléculas activas incorporadas. Foi possível confirmar, com o ensaio de toxicidade, que até à concentração 10 μM, tanto as células dendríticas como as tumorais, toleraram a biomolécula activa anti-PD-L1 na sua forma livre e quando incorporada em NP de PLA, o que confirmou a sua potencial utilização no tratamento de melanoma. Para concentrações mais elevadas, a incorporação da biomolécula activa 11 anti-PD-L1 foi claramente vantajosa, por ter um menor efeito na viabilidade celular. Para além disto, o facto de apresentarem maior toxicidade nas células tumorais pode constituir uma vantagem apesar do mecanismo associado não ter sido identificado. Apesar do potencial inibitório desta molécula anti-PD-L1 ser inferior ao do anticorpo monoclonal testado, esta abordagem terapêutica tem claras vantagens para a sua potencial aplicação in vivo, nomeadamente a nível da redução de efeitos secundários adversos, daí que tenha que ser feito um compromisso entre eficácia e segurança. Considerando o trabalho aqui reportado, é possível concluir que a optimização de NP poliméricas para o transporte de uma pequena molécula moduladora do checkpoint imunológico PD-L1, permitiu desenvolver uma abordagem terapêutica promissora para o tratamento do melanoma, que futuramente, poderá ser usada como alternativa aos anticorpos monoclonais. Em particular, a incorporação de misturas da biomolécula activa anti-PD-L1, com antigénios tumorais e imunopotenciadores em NP poliméricas, representa uma abordagem promissora para potenciar uma resposta imunitária anti-tumoral mais robusta e eficaz, com indução de memória. Assim, a entrega simultânea de TAA e imunoadjuvantes da resposta imunitária diretamente às células apresentadoras de antigénios, as DC, com moléculas bioactivas contra mecanismos de supressão da resposta imune, poderá representar uma estratégia terapêutica inovadora, não só para o melanoma, mas para o cancro no geral.

2021-02-26Master thesis

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Targeting the proteasome in anticancer therapy by a computational based drug discovery approach

Publication . Guedes, Romina; Guedes, Rita Alexandra do Nascimento Cardoso; Salvador, Jorge António Ribeiro; Gavioli, Riccardo

The ubiquitin-proteasome system plays an important role in cellular homeostasis and also has a critical role in regulating a wide variety of cellular pathways, including cell growth and proliferation, apoptosis, DNA repair and transcription. The proteasome is an essential multicatalytic protease that directs the majority of intracellular protein degradation in eukaryotic cells. Defects in these pathways have been implicated in several human pathologies, including cancer. This project relies on a chemical-based drug discovery campaign to develop alternative new, selective and more effective proteasome inhibitors. The efforts to discover new anticancer drugs proposed here combine computer-aided drug design, in vitro assays, preparation of derivatives and analysis of chemical patterns. A structure-based virtual screening campaign of commercial and in house databases led to the selection of 286 compounds for biological evaluation. In vitro assays comprised proteasome inhibition assays, as well as cell viability assays. Two potential hit compounds were selected: compound 6.8 and compound 6.15, both with IC50 values in the low micromolar range. Compound 6.15 was selected as a hit compound and a small set of derivatives were synthesized. Compound 7.2 showed to be the most promising derivative, being observed improvements in the inhibitory activity and cytotoxicity. The analysis of the ligand interactions in the three active sites revealed that the number of interactions with relevant residues decrease from the CT-L to the C-L and T-L active sites. The analysis of a curated dataset of 680 proteasome inhibitors was performed to assess how different chemical descriptors coupled with statistical tools can be used to extract activity patterns. Multiple instances of structure-activity relationship were observed. A decision tree was built and two meaningful decision rules were identified. The knowledge obtained with all the computational and in vitro results, as well as the chemical patterns identified, provide useful insight that can be applied in future drug discovery projects.

2019-12Doctoral thesis

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Nanoplatform to modulate dendritic cells and tumor microenvironment against triple negative breast cancer

Publication . Verdial, Mafalda Carvalho; Ferreira, Helena Isabel Fialho Florindo Roque; Moura, Liane Isabel Ferreira

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), o cancro da mama é o tipo de cancro mais comum em mulheres, representando 24,2% de todos os cancros. Representa a maior taxa de mortalidade, relacionada com cancro, nas mulheres. Adicionalmente, é o segundo tipo de cancro mais frequente, e a sua incidência mundial tem vindo a aumentar nos últimos anos. Anualmente, estima-se que mais de 2,1 milhões de mulheres são diagnosticadas com a doença e que mais de 627,000 acabam por padecer desta patologia. A OMS estima que até 2020 uma em cada oito mulheres será afetada por esta doença. A taxa de mortalidade varia entre os diferentes subtipos de cancro, sendo o cancro da mama triplo negativo (CMTN) o mais agressivo. O cancro da mama triplo negativo (CMTN), que representa cerca de 10-15% de todos os cancros da mama, é um subtipo molecular do cancro da mama caracterizado pela ausência de expressão dos recetores de estrogénio, progesterona e ausência da sobre expressão de HER2. É, normalmente, associado a piores prognósticos resultantes de metastização precoce (1 a 3 anos após o diagnóstico) para o cérebro, pulmões e fígado. Adicionalmente, é resistente à quimioterapia. É mais comum em mulheres jovens (abaixo dos 40 anos) especialmente de ascendência Africana, portadoras de mutações germinais do gene BRCA1. Os indivíduos diagnosticados com esta doença apresentam um mau prognóstico e falecem rapidamente quando comparado com outros subtipos de cancro da mama, o que se pode dever ao seu comportamento agressivo, mas também à não existência de uma terapia específica e direcionada. Contrariamente aos outros subtipos, doentes afetadas pelo CMTN não beneficiam de terapia hormonal ou direcionada para o HER2, devido à ausência destes biomarcadores, o que diminui significativamente as opções de tratamento e, por conseguinte, de recuperação. Assim, a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia, tanto individualmente como em combinação, são atualmente, as únicas opções terapêuticas disponíveis. A quimioterapia tem sido o tratamento mais frequentemente aplicado, no entanto, esta abordagem terapêutica está associada a uma resposta fraca por parte da maioria dos doentes, toxicidade e eventual desenvolvimento de resistência aos agentes quimioterapêuticos. Por estas razões, considera-se urgente o desenvolvimento de terapêuticas direcionadas para o CMTN. Novos conhecimentos relativos aos mecanismos moleculares da progressão da doença permitiram o desenvolvimento de novas terapias que têm como alvos biomarcadores específicos do CMTN. Estes representam componentes das cadeias de sinalização indispensáveis para o crescimento, sobrevivência, invasão e progressão do tumor. Consequentemente, existem inúmeras novas moléculas, tanto em monoterapia como em combinação, em ensaios clínicos em fase I, II e III. É de notar que algumas destas terapias já foram aprovadas para o tratamento de outros tipos de cancro, tanto pela US Food and Drug Administration (FDA) como pela Agência Europeia do Medicamento (AEM). Nos últimos anos, a imunoterapia tem vindo a ganhar reconhecimento como uma possível opção de tratamento para certos tipos de tumor, sendo que o CMTM é um destes potenciais candidatos. A imunoterapia passou de uma “terapia promissora” para uma realidade clínica já bem comprovada. Diversas opções imunoterapêuticas foram já aprovadas pelas agências reguladoras do medicamento norte-americana (FDA) e europeia (EMA), e muitos outros estão em ensaios clínicos, como monoterapia ou combinado com tratamentos convencionais ou outros agentes direcionados. Estas terapêuticas inovadoras, baseiam-se em respostas anti-tumorais desencadeadas pelo próprio sistema imunitário do doente, através da ativação de uma complexa rede de células imunitárias, tais como os linfócitos T efetores CD8+ e os linfócitos T auxiliares CD4+, mas também em respostas de memória que impeçam a formação de metástases e a disseminação da doença. Contrariamente aos outros subtipos de cancro da mama, o microambiente tumoral do CMTN apresenta uma grande infiltração de linfócitos T, o que aumenta a suscetibilidade dos pacientes com esta patologia para a imunoterapia. Existem dois tipos de imunoterapia que têm sido aplicados a pacientes com CMTN em ensaios clínicos, são eles: os moduladores de immune checkpoints e as vacinas anti tumorais. Os immune checkpoints são um conjunto de moléculas co-estimuladoras e co-inibitórias envolvidas na ativação de complexas vias de sinalização que previnem a ativação excessiva dos linfócitos T em condições normais. No ambiente tumoral, a expressão dos immune checkpoints está alterada, evitando a resposta imunitária anti-tumoral mediada pelos linfócitos T. Os anticorpos monoclonais (mAb) direcionados para estas moléculas permitem reverter a inibição da imunidade adquirida e, assim, contribuir para a sobrevivência dos pacientes. Um dos mAb em estudo em ensaios clínicos para o tratamento do CMTN é direcionado contra o OX40. O OX40 é um recetor co-estimulador expresso pelos linfócitos T, cuja ativação, induz a expansão e sobrevivência dos linfócitos T efetores e bloqueia a ação inibitória dos linfócitos T reguladores no microambiente tumoral. No entanto, apesar de resultados promissores, estes têm sido associados, em particular quando usados em regimes de monoterapia, a efeitos adversos graves e a baixas taxas de respostas prolongadas em doentes com cancro metastático, para além de haver uma grande variabilidade de respostas ao tratamento. As vacinas anti-tumorais apresentam-se, então, como uma alternativa possível. Contudo, até agora, foram incapazes de produzir melhorias clínicas evidentes em ensaios clínicos. Torna-se, assim, imperativo ultrapassar estes obstáculos associados a estas duas opções imunoterapêuticas quando usadas individualmente. A solução natural tem sido a terapêutica combinatória. Ao combinar dois ou mais agentes terapêuticos que possuem mecanismos de ação diferentes, mais células cancerígenas devem ser destruídas, melhorando assim a resposta geral dos doentes à terapêutica. Por conseguinte, este trabalho consistiu no desenvolvimento de uma nanovacina multifuncional com o objetivo de remodelar o microambiente tumoral tornando-o susceptível à resposta imunológica mediada por células como consequência da ativação do immune checkpoint OX40, e assim melhorar a resposta imunitária anti-tumoral. Com esse objetivo foram desenvolvidas nano-vacinas anti-tumorais baseadas em nanopartículas (NPs) biodegradáveis constituídas por uma matriz de ácido polilático (PLA), direcionadas para as células dendríticas (DCs) e para o microambiente tumoral. Para a indução de uma reposta anti-tumoral específica, este nanosistema incorporou o antigénio K-ras(LT) cuja expressão está aumentada no CMTN, ligandos dos recetores toll-like, nomeadamente CpG-ODN e Poly(I:C) para potenciar a resposta imunitária, juntamente com o siRNA direcionado contra o TGF-β, uma importante citocina imunossupressora. A matrix das NPs foi modificada com ácido hialurónico de forma a promover a ativação das DCs, mas também direcionar as NPs para o microambiente tumoral, aumentando o seu tropismo para o recetor CD44, o qual se encontra sobre-expresso nas células de CMTN. As NPs apresentaram um diâmetro hidrodinâmico médio de cerca de 200 nm, com um índice de polidispersão baixo, carga à superfície da NP próxima da neutralidade, e eficiência de encapsulação superior a 60%. As NPs foram extensivamente internalizadas pelas DCs e células de CMTN, sem afetar as suas viabilidades. Adicionalmente, as NPs induziram a ativação e maturação das DCs, aumentando significativamente a expressão de diferentes marcadores de superfície, e permitiram reduzir significativamente a expressão do TGF-β in vivo. Os murganhos inoculados com células de CMTN E0771 e tratados com a nanovacina combinada com o mAb anti-OX40 demonstraram uma notável remissão do tumor, com um aumento de sobrevivência geral, apresentando um volume de tumor mais de 2 vezes menor que o obtido pelos murganhos tratados com o mAb anti-OX40. A nanovacina permitiu remodelar o perfil imunológico dentro do microambiente tumoral, o que se correlacionou com o efeito antitumoral geral obtido neste esquema combinatório. Este estudo revelou a sinergia entre uma nano-vacina multifuncional e o mAb anti-OX40 no CMTN, fornecendo informações importantes para o estabelecimento de novos regimes de tratamento tendo em vista uma maior eficácia no controlo deste tumor. Além disso, este trabalho mostrou que as células do estroma tumoral são capazes de encapsular nanopartículas, tornando-as alvos promissores para o tratamento do cancro da mama.

2021-02-23Master thesis

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