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- Domínio público militar: admissibilidade de uso privativoPublication . Morais, Sandra Patrícia Reis; Martins, Ana GouveiaO domínio público militar é uma área do Direito Público que não tem colhido o interesse da doutrina portuguesa. O seu estudo torna-se assim imperioso para assegurar a aplicação adequada da legislação aos bens dominiais militares, tendo presentes as suas particularidades e especificidades e o papel crucial que desempenham na missão de salvaguarda e proteção da Soberania do Estado, constitucionalmente incumbida às Forças Armadas e à Defesa Nacional. Constitui objeto desta dissertação indagar da admissibilidade de uso privativo de bens dominiais militares. Para tanto, analisa-se na Parte I o conceito de domínio público e procede-se ao seu enquadramento constitucional e legal. O domínio público militar tem raízes jurídicas muito antigas, razão pela qual recorremos à análise de ordenamentos jurídicos vizinhos como o francês, o italiano e o espanhol, designadamente sobre o estatuto jurídico, os tipos de classificações conferidas aos bens militares, o regime que lhes é aplicável e como é desenvolvida a sua gestão, rentabilização e valorização. Na Parte II debruçamo-nos sobre a composição, a titularidade do domínio público militar e o regime jurídico que o disciplina, caraterizado pela dispersão legislativa e adoção de normas que suscitam complexas dificuldades interpretativas. É chegado o momento, na Parte III, de aferir quais os tipos de usos de bens dominiais em geral e em particular como é possível classificar o tipo de utilização de bens dominiais pelos membros das Forças armadas. Conclui-se com a defesa da admissibilidade de uso privativo de bens dominiais militares, propondo-se uma solução que a nosso ver se coaduna com a finalidade e utilidade públicas desses bens, no integral respeito do estatuto dominial, mediante o recurso a instrumentos de gestão, rentabilização e valorização do imobiliário dominial militar, solução que harmoniza e melhor serve os interesses do Estado e a missão das Forças Armadas e da Defesa Nacional.
- Loyality shares: admissibilidade da figura das ações de lealdade nas sociedades anónimasPublication . Cabo, Débora Mestre; Gomes, José FerreiraO presente trabalho centra-se na admissibilidade da aplicação da figura das ações de lealdade, enquanto figura que visa premiar um acionista que durante um determinado lapso temporal (período de lealdade) mantém as suas ações, no seio das sociedades anónimas portuguesas. Estas são criadas como um modo de combate às políticas que se centram no lucro imediato (políticas de short-termism), de alienação rápida das ações e de pouco, ou nenhum, envolvimento entre o investidor e a sociedade. Por isso, nascem e possuem uma intrínseca relação com o sócio, tendo consequentemente um carácter intuitus personæ, sem o qual não existem. Desta sua ligação ao sócio resulta que esta figura se afasta daquilo que habitualmente caracteriza uma sociedade anónima, onde o carácter personalístico é preterido. Observámos, através do estudo de ordenamentos jurídicos onde a figura já vigora, como é o caso de França e Itália, o conteúdo das ações de lealdade. As mesmas contemplam um benefício extra, usualmente um direito de voto duplo ou a atribuição de um dividendo majorado e, por isto, concluímos que os direitos advindos destas apresentam-se como direitos especiais, em contraposição aos direitos gerais que são aqueles que são adquiridos por todos os sócios. Por tal, fomos obrigados a concluir que a sua existência apenas se coadunaria com o regime societário português se as mesmas fossem inseridas e transmitidas através de categorias de ações, mas tal adequação é impossível por, tal como explanámos supra, as mesmas conterem um carácter personalístico, obstando este a que as ações de lealdade sejam tratadas enquanto categorias e não estando dependentes do sócio que as detém. Pelo facto de se apresentar como um benefício extra foi, ainda, necessário introduzir uma pequena abordagem ao princípio da igualdade dos sócios, que aqui usámos no sentido de ser um princípio da proporcionalidade, por nas sociedades se atribuírem direitos (deveres) aos sócios na proporção das suas ações. Do qual resultou que, segundo a lei portuguesa, não existe qualquer impossibilidade de determinados sócios possuírem mais (ou menos) direitos que outros. Atendemos ainda à (in)compatibilidade do regime de transmissão de ações de lealdade, onde a transmissão é proibida, durante o período de lealdade, com o regime de transmissão de ações em sede de sociedades anónimas no atual CSC, de tal resultou, mais uma vez, a impossibilidade de adequação de um ao outro. Face ao estudo feito, e às pequenas conclusões que fomos apresentando, concluímos que é impossível, à luz do quadro jurídico atual e do modo como está desenhado o regime das sociedades anónimas no CSC, a aplicação do regime das ações de lealdade por o mesmo ser incompatível com o primeiro.
- O exercício das responsabilidades parentais por terceiros e a relevância da afectividade no seu contextoPublication . Almeida, Joana Cristina Coelho dos Santos; Morais, Daniel de Bettencourt RodriguesÉ inegável a constatação de que as ligações consanguíneas presumem a ideia generalizada de que os pais biológicos constituem o meio natural e imprescindível para o harmonioso e saudável desenvolvimento das crianças, vislumbrando a proximidade e a vinculação afectiva existente no seio familiar. Todavia, face a situações de confiança prematura de crianças a terceiros cuidadores, o legislador português não adoptou uma postura indiferente e passiva relativamente à importância e ao devido respeito a atribuir às ligações psicológicas profundas estabelecidas. De facto, devido à ausência prolongada dos pais, desde o nascimento ou idade muito precoce, as crianças constroem e fortalecem a sua personalidade assumindo a imagem destas terceiras pessoas como suas figuras primárias de referência, em que elos afectivos se consolidam e um sentimento de pertença reina, desenvolvendo-se laços semelhantes à filiação. No entanto, não possuindo a devida cobertura jurídica, afigura-se imperativo a instauração de uma acção judicial no sentido de tutelar tais relações de facto, por forma a respeitar o direito das crianças a preservar as suas relações afectivas estruturantes, de grande significado e de referência para o seu integral desenvolvimento. Perante a introdução de novos conceitos jurídicos como o afecto e a relação afectiva, o ordenamento jurídico português com a Lei de Protecção, em consonância com o Código Civil, prevê tal conjuntura como situações de perigo em que, vivendo numa situação de instabilidade e de insegurança, a criança, pode, a qualquer momento, ser retirada da família de facto que reconhece como sua. Considerando que a procriação biológica não coincide, em absoluto, com a capacidade parental, procura-se salientar a importância da necessidade dos Tribunais portugueses, em conformidade com o Tribunal Europeu dos Direitos Humanos, nortearem a sua actuação tendo como fito o superior interesse da criança, atribuindo primazia a uma relação baseada em cuidados, afectos e segurança, independentemente de vínculos biológicos.
- Produção de cervejas com baixo teor de glúten por co-fermentação com bactérias láticasPublication . Sousa, Mariana Gracias Coelho de; Prista, Catarina Geoffroy; Santos, Marisa VenturaO glúten é uma fração proteica presente em diversos cereais (trigo, centeio, cevada, aveia e cereais derivados), responsável por provocar alergias ou intolerâncias. Sendo a cerveja uma bebida elaborada por cereais, é uma bebida com glúten, impossibilitando o seu consumo por indivíduos com estas patologias. Consequentemente, o desenvolvimento de cervejas com menor teor de glúten, e que simultaneamente mantenham as características sensoriais típicas desta bebida, constitui um desafio à Indústria Alimentar. O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver uma cerveja sensorialmente apelativa de estilo Weissbier, com menor teor de glúten por co-fermentação com bactérias ácido láticas (BAL). Assim, foi produzido um mosto típico de uma cerveja Weissbier, com elevado teor de glúten, realizando-se duas fermentações utilizando Lb. brevis e Lb. plantarum e uma estirpe comercial de S.cerevisiae (Blanche) (fermentação sequencial e fermentação simultânea), comparando os resultados com uma fermentação padrão apenas com S.cerevisiae. Durante os ensaios fermentativos acompanhou-se a evolução microbiológica (contagem de células viáveis e cultiváveis) e físico-química (ºBrix, pH, açúcares e ácidos orgânicos por HPLC). As cervejas obtidas foram analisadas relativamente ao teor de glúten (método ELISA) e amido (método da alfa-amilase), e ao grau de aceitação através de uma análise sensorial. As fermentações realizadas foram bem-sucedidas não se verificando um impacto considerável das BAL nos parâmetros físico-químicos da cerveja, sobretudo no ensaio em simultâneo, atingindo-se níveis de etanol (2,8-4,5 %(v/v)) e açúcares residuais (6,4-7,85 g/L) similares ao ensaio de controlo. Por sua vez, a fermentação com BAL levou à redução do teor de glúten, sendo esta redução mais significativa na Fermentação Sequencial (de 113,1 ppm para 83,4 ppm), podendo ser considerada uma cerveja com “teor muito baixo de glúten”. No entanto, dado que esta bebida ainda contém glúten, não será destinada a doentes celíacos, mas sim a indivíduos com interesse em produtos com menor teor de glúten.
- Avaliação da estabilidade oxidativa e do valor biológico de óleo de girassol suplementado com extratos de Pelvetia canaliculataPublication . Sousa, Gabriela Sofia Pires; Vicente, Maria Suzana Leitão Ferreira Dias; Tecelão, Carla Sofia RamosO presente estudo teve por objetivo aumentar o valor biológico e a estabilidade oxidativa de óleo de girassol, através da adição de compostos bioativos de Pelvetia canaliculata, uma macroalga castanha amplamente distribuída pela costa portuguesa. Os compostos bioativos da macroalga liofilizada foram diretamente extraídos para o óleo de girassol por ação de ultrassons (US). Os ensaios foram realizados de acordo com uma matriz central compósita rotativa, onde foram estudados dois fatores - concentração de alga e tempo de extração por ultrassons, de modo a determinar as condições que maximizam a estabilidade oxidativa e o valor biológico do óleo. Nas amostras de óleo suplementado foram determinados vários parâmetros: acidez, produtos de oxidação, análise sensorial, teor de clorofilas e carotenoides, características cromáticas, teor de fenóis e flavonoides, atividade antirradicalar (DPPH) e antioxidante (FRAP). A acidez, a quantidade de produtos de oxidação e o teor de flavonoides não foram afetados pelas condições de extração. O teor de clorofilas e carotenoides aumentou linearmente com a concentração da alga. Consequentemente, as amostras de óleo suplementado apresentaram uma cor amarela mais intensa. Observou-se uma relação linear entre o teor fenólico e a atividade antioxidante dos óleos suplementados. Tal parece indicar que os fenóis extraídos da macroalga poderão ser os compostos responsáveis pelo aumento da atividade antioxidante das amostras suplementadas. Realizaram-se ensaios de armazenamento acelerado a 40 ºC (8 semanas) e 60 ºC (2 semanas) da amostra suplementada com 12,5 % (m/v) de alga durante 20 min de US. Não houve alterações significativas nos teores de pigmentos clorofilinos nem de carotenoides, nem nas caraterísticas cromáticas de ambos os óleos ao longo destes ensaios. O método do DPPH revelou ser adequado para seguir a estabilidade oxidativa das amostras. A atividade antirradicalar foi superior nas amostras suplementadas, o que indica maior estabilidade oxidativa desse óleo.
- Estudo das alternativas alimentares à base de proteína vegetal: tempeh de tremoçoPublication . Fonseca, Joana Filipa Agostinho da; Prista, Catarina Geoffroy; Santos, Marisa VenturaO constante crescimento da população mundial tem implicações na produção alimentar, que deverá aumentar de forma a suprir as necessidades nutricionais da população, mas tendo em atenção a sustentabilidade do planeta. O consumo de leguminosas como fonte proteica alternativa à proteína animal, permite reduzir os recursos usados e diminuir as emissões de gases com efeito de estufa, constituindo uma forma de consumo, não só ambientalmente mais sustentável, como com vantagens para a saúde humana, em particular se forem leguminosas fermentadas. A principal leguminosa utilizada como alternativa é a soja, estando o mercado de substitutos de carne repleto de diferentes produtos à base de soja. No entanto, problemas como a desflorestação associada ao cultivo e necessidade de importação de soja, com consequente aumento da pegada ambiental, tornam a sua utilização em Portugal ambientalmente pouco sustentável. O tempeh, um alimento indonésio, tradicionalmente obtido por fermentação de grãos de soja inoculados com Rhizopus oligosporus, é um dos produtos usados como substituto da carne. O tempeh pode ser produzido a partir de várias outras leguminosas, entre as quais o tremoço, uma leguminosa nutricionalmente semelhante à soja e com tradição de consumo em Portugal. O objetivo deste trabalho foi equacionar as potencialidades do tremoço como substituto da soja na produção de tempeh. Com base em trabalhos experimentais publicados por diversos investigadores, foram avaliados aspetos como o conteúdo nutricional, o processo de fermentação e a análise sensorial do tempeh de tremoço. Esta análise permitiu concluir que o tempeh à base de tremoço pode ser considerado uma alternativa válida à utilização de tempeh de soja, estando em linha com as principais tendências de consumo e constituindo um alimento rico em proteína, capaz de atrair o consumidor devido aos seus benefícios ambientais e nutricionais.
- Desenvolvimento de novo produto na categoria healthy foods – Salus Bee, Cápsulas de Pólen, Própolis e EquináceaPublication . Dias, Inês Filipa Marques; Raymundo, Anabela MoreiraO objetivo desta dissertação assenta no desenvolvimento de um produto inovador incluído na categoria de healthy foods, apenas elaborado com ingredientes naturais, sem incorporação de aditivos e com processamento mínimo. Uma vez que este desenvolvimento está a ser efetuado em conjunto com a empresa que o irá comercializar, BeeLiever, será também efetuado o plano de marketing para lançamento do produto e elaborado respetivo packaging. O que se pretende no final da dissertação é obter um produto que possa ser lançado no mercado, com o objetivo de promover e dar a conhecer aos consumidores os benefícios associados e características únicas dos produtos provenientes da colmeia, que por sua vez possuem propriedades únicas, que infelizmente ainda são muito pouco conhecidas e valorizadas. Com o intuito de contextualizar o objeto de estudo deste trabalho, começa-se por abordar a história da apicultura, conhecimento dos consumidores em relação aos produtos provenientes da colmeia e realiza-se uma caracterização do setor apícola na União Europeia. Seguidamente, é efetuada caracterização dos ingredientes que constituem o produto, nomeadamente Pólen, Própolis e Equinácea, de modo a que possa ser percecionado o porque da sua escolha para o desenvolvimento deste produto, com destaque para as suas propriedades benéficas para a Saúde Humana. Após contextualização do tema e caracterização dos ingredientes, é efetuado um resumo da legislação aplicável ao produto em causa, justificando a legislação em vigor que teve de ser tida em consideração para o desenvolvimento do produto. A partir dos resultados obtidos pela realização da presente dissertação, foi possível elaborar a ficha técnica do produto, respetivo packaging, de acordo com a legislação em vigor, e estabeleceu-se o plano de marketing. Deste modo, os objetivos inicialmente estabelecidos foram cumpridos, encontrando-se o produto pronto para ser lançado no mercado. O lançamento oficial do produto será no dia de apresentação da dissertação, em 2021.
- Combinational nanovaccine against colorectal cancerPublication . Coelho, Raquel Ferreira; Ferreira, Helena Isabel Fialho Florindo Roque; Rodrigues, Cecília Maria PereiraO cancro colorectal (CRC) é um dos tipos de cancro com maior prevalência a nível mundial, sendo responsável por um elevado número de mortes anualmente. O CRC resulta da acumulação de mutações genéticas e epigenéticas em células do trato gastrointestinal, nomeadamente em oncogenes e em genes supressores de tumor. Estas mutações acabam por resultar em alterações histológicas e morfológicas do colón, tais como o desenvolvimento de pólipos pré-cancerosos benignos que podem evoluir para neoplasmas e, subsequentemente, para carcinomas invasivos, caso não sejam tratados. Apesar de existirem formas da doença associadas a fatores hereditários, a esmagadora maioria dos casos de CRC são esporádicos e são resultado de mutações em células somáticas. O CRC pode ser curado em fases iniciais da doença, através da remoção cirúrgica do tumor e de quimioterapia. A radioterapia pode também ser útil para reduzir o risco de recorrência do tumor em alguns doentes. Contudo, muitos destes doentes já apresentam metástases na altura do primeiro diagnóstico, e muitos outros desenvolvem metástases ou recorrência local do tumor após remoção cirúrgica do mesmo. Formas metastáticas da doença são normalmente incuráveis e apresentam uma taxa de sobrevivência a 5 anos inferior a 10%. Assim, é necessário o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas capazes de tratar CRC metastático e de induzir remissões prolongadas desta doença. Uma vez que o cancro é uma doença multifatorial, na qual várias vias moleculares de sinalização estão envolvidas, nos últimos anos têm surgido várias abordagens combinatórias, que têm como alvo múltiplas destas vias de sinalização, com vista ao desenvolvimento de um tratamento mais eficaz para o CRC. A imunoterapia tem demonstrado um enorme potencial para tratar vários tipos de cancro, incluindo o CRC. Esta abordagem faz uso da capacidade do sistema imunitário de erradicar células tumorais, de forma eficaz e com melhor tolerância do que outras terapias mais convencionais, como é o caso da quimioterapia. As vacinas terapêuticas para o cancro constituem um exemplo de uma abordagem imunoterapêutica em desenvolvimento, as quais promovem a apresentação de antigénios específicos tumorais às células T, por células dendríticas (DC), resultando assim numa forte resposta imunológica assente na ação de células T ativadas contra as células tumorais. Apesar de promissoras, a sua aplicação clínica tem sido limitada, encontrando-se em estudo a sua associação com outros moduladores do microambiente tumoral de forma a aumentar a sua eficácia, bem como sensibilizar o microambiente tumoral para outras abordagens imunoterapêuticas, aumentando a resposta destes tumores agressivos, por exemplo, a modeladores da função de immune checkpoints. De facto, o microambiente tumoral é constituído por diferentes tipos de células, incluindo células do sistema imunitário, tais como linfócitos T e B, DC e macrófagos. As células tumorais possuem uma enorme influência nas células do microambiente tumoral, tornando-o altamente imunossupressor. Desta forma, as células do sistema imunológico que infiltram os tumores perdem as suas funções anti-tumorais e, em vez disso, promovem o crescimento e capacidade invasiva das células cancerígenas. Em especial, as células T regulatórias (Treg) e os macrófagos associados ao tumor (TAM) são abundantes no microambiente do CRC. As Treg são, em contexto fisiológico, essenciais para prevenir a autoimunidade. No entanto, no microambiente tumoral, estas células produzem moléculas imunossupressoras e inibem a produção de moléculas co-estimulatórias, resultando assim na supressão da maturação das DC e, consequentemente, na inibição da apresentação de antigénio e da resposta imunológica das células T. Os TAM também possuem um fenótipo imunossupressor dentro do microambiente tumoral, o que resulta na indução do desenvolvimento e crescimento tumoral. Para além disso, as células do microambiente tumoral produzem elevadas quantidades de TGF-β. Esta trata-se de uma citocina que apresenta um papel duplo no desenvolvimento e progressão do cancro. Por um lado, nas fases iniciais da tumorigénese, esta molécula regula a proliferação celular e a apoptose das células epiteliais do colón, apresentando um efeito anti-tumoral. No entanto, em fases mais avançadas da doença, existe uma sobrexpressão desta molécula no microambiente tumoral, em particular da isoforma TGF-β1. Durante a carcinogénese do CRC, esta isoforma induz a migração e a invasão das células tumorais, para além de contribuir para a supressão das células do sistema imunitário, através da promoção da infiltração de células Treg. Assim, tanto a presença de TAM como a produção de TGF-β1 no microambiente tumoral estão associadas a um prognóstico negativo para os pacientes de CRC. Esta tese apresenta uma nova abordagem para o tratamento do CRC, que envolve a combinação de uma nanovacina com a modulação do microambiente tumoral, nomeadamente a inibição da expressão de TGF-β1 e a inibição da função pró-tumorigénica dos TAM. Com esse objetivo, foram desenvolvidos dois tipos de nanopartículas (NP) poliméricas, biodegradáveis, constituídas por uma matriz de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA), capazes de incorporar diferentes agentes terapêuticos e de fazer a entrega dos mesmos a diferentes células alvo. Foi desenvolvida assim uma nanovacina capaz de incorporar antigénios peptídicos expressos pelo CRC, os adjuvantes Poly(I:C) e CpG-ODN e moléculas de siRNA anti-TGF-β1 (siTGF-β1) que promovem a inibição desta citocina. Esta NP foi funcionalizada com manose, de modo a promover a sua interação específica com as DC, que expressam abundantemente o recetor CD206 (também chamado recetor da manose) na sua superfície. Para além disso, a mesma nanoplataforma foi modificada de modo a promover o transporte de siTGF-β1, bem como dos imunoadjuvantes CpG-ODN e Poly(I:C) para as células tumorais. Para tal, estas NP foram funcionalizadas com o tripéptido Arg-Gly-Asp (RGD), que apresenta uma alta afinidade com as integrinas αvβ3/αvβ5, cuja expressão é acentuada na superfície das células tumorais, bem como de células endoteliais associadas a tumores. As NP formuladas apresentaram um diâmetro hidrodinâmico próximo de 200 nm e um índice de polidispersão próximo dos 0.2. Verificou-se também que as nanovacinas foram altamente internalizadas por células apresentadoras de antigénio (APC), nomeadamente macrófagos e DC, in vivo. A internalização das nanovacinas por parte das DC resultou no aumento significativo da molécula co-estimuladora CD86, bem como do complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHCI), indicando que esta levou à maturação das DC. Um estudo in vivo realizado em murganhos com CRC permitiu estudar a eficácia da nanovacina terapêutica (com siTGF-β1 na sua composição), em combinação com a NP direcionada para o microambiente tumoral e ainda em combinação com o Pexidartinib, um inibidor dos TAM. Combinações duplas entre a nanovacina e o Pexidartinib, e triplas com (1) a nanovacina, a NP direcionada ao microambiente tumoral e o Pexidartinib ou (2) a nanovacina administrada por duas vias, subcutânea (s.c.) e intratumoral (i.t.) e o Pexidartinib, foram testadas. A administração da dupla combinação Nanovaccina_ siTGF-β1 + Pexidartinib apresentou resultados mais promissores que a administração individual da Nanovacina_siTGF-β1 e do Pexidartinib, bem como resultados similares às restantes combinações triplas. Embora não tenham sido observadas diferenças significativas entre os volumes e massas médios dos tumores de animais tratados com as combinações duplas e triplas, observaram-se diferenças ao nível das populações de células do sistema imunitário que infiltraram o tumor. A combinação dupla entre Nanovacina_siTGF-β1 + Pexidartinib resultou em valores médios de volume e massa tumoral semelhantes às restantes combinações. No entanto, esta combinação promoveu uma elevada infiltração de células imunológicas no tumor, nomeadamente células T CD8+, linfócitos T citotóxicos (CTL) e células T natural killer (NK T). Esta tese destaca a importância da nanotecnologia no desenvolvimento de novas terapias para o cancro, nomeadamente para o CRC. O desenvolvimento de uma nanoplataforma capaz de incorporar diferentes biomoléculas com propriedades terapêuticas e de interagir com diferentes células alvo é de extrema importância para aumentar a eficácia do tratamento e para reduzir efeitos secundários adversos. Em particular, destaca-se o desenvolvimento de uma nanovacina que, ao ser combinada com a modulação do microambiente tumoral, através da inibição da expressão de TGF-β1 e das células TAM, parece apresentar resultados promissores num modelo animal de CRC.
- Aquaporins involvement in hepatic ischemia reperfusion injuryPublication . Fernandes, Jessica Alexandra Silva; Soveral, Graça; Corvo, Maria LuísaA lesão de isquemia-reperfusão (IR) hepática é uma complicação inevitável durante a cirurgia hepática, causada pela interrupção do fluxo sanguíneo e subsequente inflamação durante a revascularização do fígado. Uma vez que esta condição patológica tem uma alta taxa de mortalidade associada, há um interesse crescente na investigação de métodos e estratégias para prevenir e atenuar a IR hepática. A IR hepática é caracterizada por uma fase de isquemia, em que a falta de oxigénio e a depleção de ATP leva à interrupção da microcirculação e ao dano mitocondrial, e uma fase de reperfusão, distinguida pela ativação do sistema imunológico do fígado que envolve ativação de macrófagos e neutrófilos, produção de citocinas e quimiocinas, stress oxidativo e aumento da expressão de moléculas de adesão no endotélio hepático. Os mecanismos de resolução de inflamação no fígado são conhecidos uma vez que alguns mediadores anti-inflamatórios são capazes de induzir a cicatrização do tecido hepático e a proliferação de hepatócitos. O sistema hepatobiliar é responsável por diversos processos metabólicos, incluindo formação e secreção biliar, desintoxicação e metabolismo do glicerol. Como a bile é predominantemente composta por água, a formação de bile canalicular é um processo de secreção osmótica que resulta da entrada de água em resposta a gradientes osmóticos criados pela secreção activa de solutos. Quando os hepatócitos são estimulados, o transporte de água ocorre significativamente pela via transcelular através da membrana plasmática. Foi demonstrado que várias células do trato hepatobiliar expressam aquaporinas (AQPs), pequenas proteínas transmembranares conhecidas por auxiliar no transporte transmembranar de água, aumentando a permeabilidade à água e também permitindo o transporte de glicerol e outros pequenos solutos. Além disso, como durante a revascularização do fígado a permeabilidade da membrana é afectada por processos de inflamação, as AQPs situadas em várias células do fígado representam importantes reguladores do equilíbrio hemodinâmico durante a IR. Considerando o papel que as AQPs podem desempenhar durante os processos de IR do fígado, o foco deste trabalho consistiu em avaliar o efeito da IR na expressão de AQPs. O ensaio in vitro com células HepG2 expostas a diferentes estímulos de IR permitiu distinguir o efeito da inflamação do estímulo de hipoxia na expressão de AQPs. Mediante estímulo de inflamação com LPS, as células induziram a expressão de AQPs a fim de restabelecer a homeostase e atenuar os processos biológicos instigados pela sobre-expressão de mediadores da inflamação. Opondo-se à resposta inflamatória, mediante estímulo de isquemia, as células submetidas a uma câmara de hipoxia suprimem a expressão de AQPs como um mecanismo de prevenção de influxo de água nas células e manutenção da homeostase da água durante o processo inflamatório inicial e prevenção de edema celular. Além disso, a administração de formulações lipossomais de fármacos demonstrou ser eficaz na atenuação dos processos de inflamação causados pela exposição das células HepG2 a compostos tóxicos e disfunções relacionadas à inflamação nas células do fígado, já que ambos os fármacos testados (prednisolona e ibuprofeno) mostraram efeitos favoráveis na reversão da inflamação induzida por LPS, diminuindo significativamente a expressão de AQP3 e citocinas. O ensaio in vivo do efeito de IR em células de fígado de rato permitiu delinear um perfil de expressão de AQPs ao longo dos diferentes tempos do processo de IR. As células suprimiram significativamente a expressão de AQPs após 2h de reperfusão, a fim de se opor aos mecanismos decorrentes do processo de isquemia e evitar o influxo de água na célula e edema celular nas primeiras horas de reperfusão, então induziram a expressão de AQPs após 6h de reperfusão a fim de restabelecer homeostase da água e, finalmente, após 24h de reperfusão as células aumentaram a expressão de AQPs. Como a expressão de AQPs e TNF-ɑ após 24h de reperfusão se assemelhava à condição de normóxia, este ensaio confirmou que após 24h de reperfusão as células passam por processos de resolução da inflamação e retornam à homeostase. Além disso, o tratamento com o composto natural quercetina foi ineficiente em atenuar os processos de inflamação induzidos por IR, pois os perfis de AQPs assemelham-se às amostras sem tratamento. Apesar disso, a administração intravenosa de quercetina lipossomal (formada por SPC) apresentou maior expressão de AQPs do que a administração intraperitoneal de quercetina lipossomal (formada por EPC). Para uma melhor avaliação do papel das AQPs nos mecanismos de IR do fígado, devem ser realizados ensaios funcionais e, em última análise, devem ser investigadas estratégias para direcionar e regular as AQPs durante a IR do fígado com o objetivo de reduzir a alta taxa de mortalidade associada a essa condição.
- Small molecules for cancer immunotherapy: a melanoma approachPublication . Serronha, Lara Inês Silva; Ferreira, Helena Isabel Fialho Florindo Roque; Guedes, Rita Alexandra do Nascimento CardosO cancro constitui um dos principais e maiores problemas de saúde, a nível mundial, e continua a ser urgente o desenvolvimento de abordagens terapêuticas mais seguras, mas também eficazes que permitam controlar os estados mais avançados desta doença. Apesar dos progressos feitos nos últimos anos, na prevenção, diagnóstico e tratamento, a sua incidência continua a aumentar, sendo uma das principais causas de mortalidade. De facto, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) estima-se que em 2030 se registem mais de 13 milhões de vítimas mortais. Em termos gerais, o cancro engloba um vasto conjunto de doenças caracterizado por uma proliferação celular anormal e descontrolada. No caso de ser um tumor maligno, este pode desenvolver a capacidade de invadir e danificar os tecidos e órgãos adjacentes, por via linfática, num processo denominado por metastização. De todos os cancros humanos, o cancro da pele é um dos mais frequentes, e apesar de constituir uma pequena fração das neoplasias cutâneas, o melanoma representa o tipo de cancro da pele mais agressivo e mortal. O melanoma maligno é um tumor consideravelmente heterogéneo que resulta da ação combinada de diversos fatores, incluindo genéticos, individuais, ambientais, entre outros, estando o seu prognóstico fortemente relacionado com o estado da doença quando diagnosticada. Para além da excisão cirúrgica, quando diagnosticado precocemente, outras opções terapêuticas incluem a quimioterapia (com os agentes Dacarbazina e Temozolomida) e radioterapia, no entanto nenhuma delas tem um potencial igualmente curativo e os resultados clínicos são limitados. O melanoma avançado, e na sua forma metastática, é altamente caraterizado pela resistência à maioria das terapias convencionais e a sua mortalidade aumenta por falta de outras opções eficazes de tratamento. Assim, as terapias têm vindo a evoluir a partir de estratégias relativamente inespecíficas, para abordagens mais direcionadas. A partir de 2011 doentes afetados pela forma disseminada desta doença passaram a poder usufruir de novos agentes terapêuticos direcionados para alvos específicos identificados como estando associados aos estados mais agressivos desta doença. Destacam-se a aprovação de inibidores de BRAF/MEK, e mais tarde, de moduladores de vias de sinalização associadas a immune checkpoints. A imunoterapia, em oncologia, tem como objetivo restaurar ou amplificar uma resposta imune anti-tumoral por parte do hospedeiro, através da activação de uma rede complexa de células, que inclui linfócitos CD8+ efectores e CD4+ auxiliares, linfócitos B, células natural killer (NK), células dendríticas (DC), entre outras, bem como a libertação de citocinas e mediadores inflamatórios por parte destas células efectoras. No entanto, o tumor tem a capacidade de utilizar mecanismos de supressão fisiológicos, para 9 escapar a uma resposta imunitária, e criar um microambiente tumoral que favorece a sua proliferação e crescimento. Entre outros, o aumento da expressão de moléculas de regulação da resposta imune, que inclui os recetores proteína 4 associada aos linfócitos T citotóxicos, CTLA- 4, e morte celular-programada 1, PD-1, como mecanismo de inibição da ativação dos linfócitos T, estão entre os mecanismos mais utilizados para bloquear a acitividade anti-tumoral do sistema imunitário. Desta forma, o desenvolvimento de terapias que inibam estas moléculas, conhecidas como “immune checkpoints”, afigura-se como promissor no combate a um crescente número de tumores. Mais especificamente, a aprovação de anticorpos monoclonais anti- PD-1/PD-L1, como o Pembrolizumab e Nivolumab, tem vindo a revolucionar as opções de tratamento para doentes com melanoma, tendo já demonstrado benefícios clínicos e aumento de respostas objetivas, quando comparados à quimioterapia tradicional. No entanto, o aparecimento de mecanismos de resistência primária ou adquirida, e a indução de efeitos adversos são alguns dos fatores que ainda limitam a sua utilização. Além disso, ainda que a combinação destes modeladores com outras abordagens terapêuticas tenha permitido melhorar alguns destes aspetos, apenas uma percentagem de doentes responde a estas terapêuticas combinadas, observando-se o desenvolvimento de resistências. Desta forma, torna-se urgente o desenvolvimento de alterativas imunoterapêuticas que permitam sensibilizar o microambiente tumoral de forma a que volte a ser susceptível à ação anti-tumoral destas abordagens atualmente tão clinicamente relevantes. Recentemente, a utilização de pequenas moléculas como inibidores de immune checkpoints tem vindo a receber maior atenção devido às vantagens que apresentam sobre os convencionais anticorpos monoclonais, nomeadamente: capacidade de atravessar várias barreiras fisiológicas e biológicas; maior permeabilidade celular e difusão no microambiente tumoral, especialmente no caso de tumores sólidos; melhoria no perfil farmacocinético e farmacodinâmico; diminuição dos efeitos adversos; menor custo de produção e possibilidade para administração oral, entre outras. Para além disto, o avanço na nanotecnologia e no desenvolvimento de nanoestruturas para “drug delivery” tem vindo a possibilitar a síntese de nanomateriais com diferentes características, dependendo da ação terapêutica pretendida, bem como das propriedades fisico-químicas das moléculas ativas que por eles serão transportadas. Assim, a incorporação destas pequenas moléculas imunomoduladoras, assim como antigénios tumorais e potenciadores de resposta imune, em nanopartículas (NP) biocompatíveis e biodegradáveis irá, não só, permitir uma entrega eficaz, segura, e não-tóxica, mas também, aumentar a sua acumulação específica no local de interesse. Para além disso, irá também permitir uma libertação controlada do composto10 melhorando ainda mais a já promissora abordagem da inibição de immune checkpoints com pequenas moléculas com actividade biológica. Para além disso, a capacidade de modificação das propriedades biofísicas (ex: tamanho, carga e morfologia) das NP permite obter nanoplataformas de entrega desenhadas tendo em vista a sua interação com os sistemas biológicos alvo, aumentando a eficácia desta abordagem terapêutica. Assim, o principal objectivo do trabalho aqui descrito foi desenvolver NP poliméricas de ácido poliláctico (PLA) capazes de incorporar uma pequena molécula anti-Ligando-1 do Recetor da Morte Celular Programada, PD-L1 e a avaliação do seu efeito em células imunes e tumorais. Para tal, o efeito da pequena molécula #56 anti PD-L1 livre ou incorporada nas NP na viabilidade celular foi avaliado em duas linhas celulares (células dendríticas JAWSII (ATCC® CRL-11904™), melanoma, B16F10 (ATCC® CRL-6475™)), que representam subpopulações que expressam níveis mais elevados de PD-L1 no microambiente tumoral altamente imunosupressor. Avaliou-se de igual forma o efeito desta pequena molécula, livre ou incorporada nas NP, na inibição do PD-L1 na linha celular de melanoma anteriormente referida. Sendo que a indução de uma resposta imunológica robusta com a estimulação de linfócitos T CD4+ e CD8+, depende também da apresentação eficaz de antigénios tumorais pelas DC, actualmente reconhecidas como entidades fundamentais na estimulação de uma resposta imune eficaz, foi preparada e caracterizada uma NP multivalente, tendo em vista o transporte de combinações da pequena molécula anti PD-L1, com péptidos antigénicos de melanoma (Melan-A/MART-1) e o imuno potenciador CpG, de forma a que o expectável efeito sinérgico resulte numa maior eficácia anti-tumoral. Os resultados aqui descritos demonstram que as NP desenvolvidas, utilizando os métodos de única ou dupla emulsão com evaporação de solvente, apresentaram as características ideais para os objectivos anteriormente descritos, com um diâmetro hidrodinâmico médio inferior a 200 nm, uma distribuição de tamanhos homogénea (PdI < 0.2) com carga superficial negativa inferior a -8 mV. Importa realçar também a estabilidade e reprodutibilidade das NP preparadas por ambos os métodos, em particular o de dupla emulsão, sendo os valores de desvio padrão, para qualquer uma das características físico químicas, mínimo. Para além disto, estas NP permitiram eficiências de encapsulação, EE (% (w/w), e capacidade de carga, LC (μg/mg), elevadas para qualquer uma das biomoléculas activas incorporadas. Foi possível confirmar, com o ensaio de toxicidade, que até à concentração 10 μM, tanto as células dendríticas como as tumorais, toleraram a biomolécula activa anti-PD-L1 na sua forma livre e quando incorporada em NP de PLA, o que confirmou a sua potencial utilização no tratamento de melanoma. Para concentrações mais elevadas, a incorporação da biomolécula activa 11 anti-PD-L1 foi claramente vantajosa, por ter um menor efeito na viabilidade celular. Para além disto, o facto de apresentarem maior toxicidade nas células tumorais pode constituir uma vantagem apesar do mecanismo associado não ter sido identificado. Apesar do potencial inibitório desta molécula anti-PD-L1 ser inferior ao do anticorpo monoclonal testado, esta abordagem terapêutica tem claras vantagens para a sua potencial aplicação in vivo, nomeadamente a nível da redução de efeitos secundários adversos, daí que tenha que ser feito um compromisso entre eficácia e segurança. Considerando o trabalho aqui reportado, é possível concluir que a optimização de NP poliméricas para o transporte de uma pequena molécula moduladora do checkpoint imunológico PD-L1, permitiu desenvolver uma abordagem terapêutica promissora para o tratamento do melanoma, que futuramente, poderá ser usada como alternativa aos anticorpos monoclonais. Em particular, a incorporação de misturas da biomolécula activa anti-PD-L1, com antigénios tumorais e imunopotenciadores em NP poliméricas, representa uma abordagem promissora para potenciar uma resposta imunitária anti-tumoral mais robusta e eficaz, com indução de memória. Assim, a entrega simultânea de TAA e imunoadjuvantes da resposta imunitária diretamente às células apresentadoras de antigénios, as DC, com moléculas bioactivas contra mecanismos de supressão da resposta imune, poderá representar uma estratégia terapêutica inovadora, não só para o melanoma, mas para o cancro no geral.