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Authors
Abstract(s)
O fígado gordo não-alcoólico (FGNA) é uma doença metabólica crónica, caracterizada pela
acumulação excessiva de gordura no fígado, muitas vezes resultante de uma dieta rica em
gorduras e calorias, e associando-se com a diabetes de tipo 2. Durante os últimos anos, a taxa
de incidência do FGNA cresceu de forma significativa, atingindo um quarto da população
mundial adulta em 2016, sendo expectável que esta tendência se mantenha. O FGNA é
caracterizado pela presença de lesões hepáticas, desde a esteatose simples até à esteatohepatite
não alcoólica (EHNA), podendo mesmo progredir para fibrose, cirrose e carcinoma
hepatocelular (CHC). Ainda que a patogénese da doença não seja bem conhecida, pensa-se que
seja uma doença bastante complexa e multifatorial, influenciada por vários fatores, incluindo
fatores genéticos, idade, sexo, e estilo de vida. É de notar que a doença se caracteriza por uma
fase precoce assintomática e, por isso, o diagnóstico ocorre numa fase mais tardia. Apesar da
reversibilidade da doença, não existem tratamentos pré-estabelecidos na prática clínica. Não
obstante, durante os últimos anos, têm sido identificados vários mecanismos que desempenham
um papel no desenvolvimento e na progressão do FGNA, sugerindo vários alvos possíveis para
o diagnóstico e para a terapêutica.
Os microRNAs são pequenos RNAs endógenos não codificantes que atuam como
reguladores da tradução de vários genes. Foi já demonstrado que vários microRNAs se
encontram desregulados nos doentes em diversos estadios do FGNA, evidenciando o seu papel
potencial quer no diagnóstico quer na terapêutica. Vários grupos de investigação, incluindo o
nosso, já demonstraram a ocorrência da regulação positiva do microRNA-21 (miR-21) no
fígado, nos músculos e no soro de pacientes com FGNA. Os nossos estudos demonstraram que
a regulação negativa do miR-21 em ratinhos alimentados com dietas deficientes em metionina
e colina provocou uma redução significativa na ocorrência de fibrose hepática, esteatose, e
inflamação. De forma semelhante, a deleção do miR-21 hepático resultou na prevenção da
intolerância à glucose e da esteatose em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gorduras.
Também foi demonstrado que a desregulação de recetores nucleares ativados por ácidos
biliares, particularmente do recetor X dos farnesóides (FXR) e do recetor 5 acoplado a proteínas
G (TGR5), desempenha um papel importante na patogénese do FGNA. Ratinhos com defiência
no FXR alimentados com uma dieta rica em gorduras desenvolveram manifestações patológicas
da EHNA, enquanto que ratinhos knockout da SHP-1, um alvo ajusante do FXR, não
desenvolveram quaisquer manifestações clínicas de esteatose hepática. Além disso, o nosso
grupo demonstrou também que a ativação do recetor FXR através de indução pelo ácido
obeticólico em simultâneo com a inibição do miR-21 em ratinhos alimentados com uma dieta
“fast-food” preveniu significativamente a progressão da doença, incluindo a restauração do
metabolismo lipídico no fígado. Por outro lado, outros autores demonstraram que a ativação do
TGR5 resulta num decréscimo da produção de citocinas pró-inflamatórias, na sobreexpressão
do GLP-1 e numa melhoria da esteatose hepática e da sensibilidade à insulina. Nesse sentido,
o INT-767, um agonista duplo dos recetores FXR e TGR5, tem vindo a ser investigado como
um potencial agente terapêutico para o tratamento do FGNA. Em ratinhos alimentados com
uma dieta rica em gorduras, o INT-767 foi capaz de melhorar o metabolismo lipídico e da
glucose, a sensibilidade à insulina, a aterosclerose e a resposta inflamatória.
O objetivo principal deste trabalho foi elucidar se o silenciamento do miR-21, através do
uso de um inibidor sintético especifico - antagomiR-21 -, e/ou a ativação dos recetores FXR e
TGR5, usando o agonista duplo INT-767, demonstram um efeito curativo no tratamento do
FGNA, prevenindo a progressão da doença. Ratinhos C57BI/6J com 3 semanas foram
alimentados com uma dieta rica em gorduras e deficiente em colina (HFCD), ou com uma dieta
controlo, durante 12 semanas. Após este período, os ratinhos demonstraram evidência de
esteatose hepática. Neste ponto, os ratinhos foram injetados com o antagomiR-21 e/ou tiveram
a sua dieta suplementada com o INT-767, durante 12 semanas adicionais. Às 24 semanas, os
ratinhos foram sacrificados e os tecidos hepático e adiposo, assim como o soro, foram
recolhidas e processados para a realização de testes histológicos, bioquímicos e moleculares. A
expressão de proteínas e genes envolvidos em várias vias de sinalização do FGNA, assim como
de vias ajusante dos recetores nucleares, foi avaliada através de técnicas de Western blot,
ELISA, e qRT-PCR. Além disso, a expressão de uma seleção de genes envolvidos no cancro
do fígado foi analisada através de técnicas de microarray por qRT-PCR .
Os resultados obtidos demonstraram que o tratamento com o antagormiR-21 e o INT-767,
de forma isolada ou simultânea, resultou numa melhoria das manifestações clínicas da doença
do FGNA, induzidas pela dieta HFCD. Ambos os tratamentos, isolados e combinados, levaram
a uma prevenção parcial do ganho de peso, normalização dos niveís séricos de enzimas
relacionadas com dano hepático, e prevenção do desenvolvimento de características
histopatológicas da doença. O tratamento com antagomiR-21 e/ou o INT-767 diminuiu
significativamente a expressão do microRNA endógeno miR-21 no fígado. Em paralelo,
observou-se um aumento da atividade dos recetores FXR e TGR5, demonstrado através da
análise dos seus alvos ajusante SHP-1 e CYP7a1; e PKAc-α, respetivamente. É de notar que a
expressão proteica de ambos os recetores FXR e TGR5 no fígado demonstrou ser positivamente
regulada após os tratamentos, possivelmente como resultado da melhoria geral na saúde dos
animais.
O tratamento com o antagomiR-21 e o INT-767, tanto de forma isolada como em
combinação, reverteu vásrias desregulações metabólicas relacionadas com o FGNA, agindo
frequentemente em sinergia. A expressão hepática da PPARα, uma proteína que nosso grupo já
demonstrou melhorar o FGNA, demonstrou ser regulada negativamente e de forma significativa
em ratinhos não tratados, alimentados com uma dieta HFCD, e positivamente em ratinhos na
dieta mas tratados com o antagomiR-21 e/ou o INT-767. Curiosamente, apesar de termos
previamente demonstrado que a PPARα é um alvo do miR-21, esta proteína sofreu uma
regulação positiva mais significativa após o tratamento com o INT-767. Além disso, o
tratamento combinado demonstrou ter um efeito sinergístico. O FGF-21, um regulador da
homeostase dos glicolipídos, muitas vezes estimulado pela PPARα, mostrou ser regulado
positivamente, quer no soro quer no fígado, pelo tratamento com o INT-767, de forma isolada
ou em combinação com o antagomiR-21.
O tratamento com o antagomiR-21 e/ou INT-767 resultou ainda numa diminuição da
desregulação mitocondrial, se bem que com efeitos sinergísticos reduzidos. É de notar que a
expressão hepática do NRF2, uma proteína com papel inibidor da esteatose hepática,
demonstrou manter-se inalterada em ratinhos alimentados com a dieta HFCD em comparação
com os ratinhos na dieta controlo. Ainda assim, a expressão hepática do NRF2 aumentou
significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou com o INT-767. A expressão
da proteína mitofusina-2, uma proteína essencial à fusão mitocondrial, aumentou
significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e o INT-767, quer de forma isolada
ou combinada. Em paralelo, a expressão heática da DRP1, uma proteína essencial à fissão
mitocondrial, diminuiu significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT767. Além disso, o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767 resgatou a regulação
positiva da expressão hepática das proteínas apoptóticas caspase-2 e -3, induzida pela dieta
HFCD, demonstrando um pequeno efeito sinergístico em ambos os casos.
Também a via de sinalização da insulina foi afetada em ratinhos alimentados com a dieta
HFCD, que exibiram aumento da fosforilação da proteína JNK, comparando com ratinhos na
dieta controlo. Por sua vez, o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767 reduziiu os
niveís de ativação do JNK. Os animais alimentados com a dieta HFCD exibiram ainda niveís
reduzidos de fosforilação das proteínas IRS1 e Akt, comparando com os animais controlo,
enquanto que os tratamentos com o antagomiR-21 e o INT-767, sozinhos ou em combinação,
reverteram quase por completo a inativação destas proteínas.
A análise da expressão génica de genes selecionados no tecido adiposo visceral
correlacionou-se com os resultados previamente obtidos no tecido hepático. Em particular, a
expressão da PPARα foi inibida em ratinhos alimentados com a dieta HFCD, comparando com
os ratinhos na dieta controlo, mas resgatada após o tratamento com antagomiR-21 e/ou INT767. De forma semelhante, a expressão da SHP-1 e do TGR5 foi resgatada após o tratamento.
A expressão da FABP4, normalmente aumentada em resposta à acumulação de lípidos, foi
inibida significativamente por ambos os tratamentos.
Finalmente, ratinhos alimentados com a dieta HFCD evidenciaram ainda a activação de vias
de sinalização oncogénicas no fígado, cujo padrão de expressão foi aproximado dos ratinhos
controlo após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767.
No seu conjunto, os resultados obtidos nesta Tese demonstram que o antagomiR-21 e/ou o
INT-767 revertem a desregulação hepática do metabolismo lipidico e da função mitocondrial,
reduzindo simultâneamente o ambiente pró-inflamatório e a apoptose. O tecido adiposo visceral
sofreu igualmente uma melhoria metabólica em ratinhos alimentados com a dieta HFCD mas
tratados com uma ou ambas as estratégias terapêuticas em estudo. Além disso, ambos os
tratamentos resultaram na regulação negativa de vários genes associados ao cancro do fígado.
Em conclusão, o tratamento isolado com o INT-767 ou o antagomiR-21 previnem a progressão
do FGNA. Além disso, o tratamento combinado foi mais eficiente no resgate das desregulações
metabólicas e na prevenção da ativação de vias de sinalização oncogénicas, devendo por isso
ser considerado como uma estratégia terapêutica putativa para o FGNA e o desenvolvimento
de cancro associado ao FGNA.
The increasing incidence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and its progression towards hepatocellular carcinoma (HCC) establishes an incentive for the research of novel therapeutic targets. With this work, we aimed to elucidate whether a combination therapy using antagomiR-21 and INT-767, a dual farnesoid X receptor (FXR) and G protein coupled receptor 5 (TGR5) agonist, could ameliorate NAFLD, as well as its progression towards HCC. C57BL/6J mice were fed a control or a high-fat choline-deficient (HFCD) diet, supplemented with or without INT-767, and/or injected with antagomiR-21 or a scrambled antagomir (control). Tissues and serum samples were collected and processed for histological, biochemical and molecular assessments. Expression of proteins and genes involved in NAFLD signalling circuits, as well as those downstream of nuclear receptors were investigated through immunoblotting, immunoassays, and qRT-PCR. Additionally, a selection of genes involved in liver cancer were analysed using gene array plates. HFCD diet-fed mice developed obesity and NASH. In turn, antagomiR-21 and INT-767, alone or in combination, prevented disease progression and weight gains. At the molecular level, the HFCD diet deregulated hepatic metabolic signalling pathways and induced insulin resistance, modulations that were rescued following treatment by either antagomiR21 or INT767 alone, and even more so by the combined treatment. The HFCD treatment further deregulated hepatic expression of mitochondrial proteins and upregulated pro-inflammatory and pro-apoptotic proteins, with antagomiR-21 and INT-767 alone or in combination reversing these effects. Moreover, antagomiR-21 and/or INT-767 also ameliorated HFCD-induced deregulation of selected genes in the visceral adipose tissue, as well as HFCD-induced activation of oncogenic signalling. In conclusion, either antagomiR-21 or INT-767 alone prevent NAFLD progression, with combined targeting more effectively preventing disease progression, thus embodying a putative therapeutic strategy for preventing NAFLD progression and NAFLD-associated HCC.
The increasing incidence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and its progression towards hepatocellular carcinoma (HCC) establishes an incentive for the research of novel therapeutic targets. With this work, we aimed to elucidate whether a combination therapy using antagomiR-21 and INT-767, a dual farnesoid X receptor (FXR) and G protein coupled receptor 5 (TGR5) agonist, could ameliorate NAFLD, as well as its progression towards HCC. C57BL/6J mice were fed a control or a high-fat choline-deficient (HFCD) diet, supplemented with or without INT-767, and/or injected with antagomiR-21 or a scrambled antagomir (control). Tissues and serum samples were collected and processed for histological, biochemical and molecular assessments. Expression of proteins and genes involved in NAFLD signalling circuits, as well as those downstream of nuclear receptors were investigated through immunoblotting, immunoassays, and qRT-PCR. Additionally, a selection of genes involved in liver cancer were analysed using gene array plates. HFCD diet-fed mice developed obesity and NASH. In turn, antagomiR-21 and INT-767, alone or in combination, prevented disease progression and weight gains. At the molecular level, the HFCD diet deregulated hepatic metabolic signalling pathways and induced insulin resistance, modulations that were rescued following treatment by either antagomiR21 or INT767 alone, and even more so by the combined treatment. The HFCD treatment further deregulated hepatic expression of mitochondrial proteins and upregulated pro-inflammatory and pro-apoptotic proteins, with antagomiR-21 and INT-767 alone or in combination reversing these effects. Moreover, antagomiR-21 and/or INT-767 also ameliorated HFCD-induced deregulation of selected genes in the visceral adipose tissue, as well as HFCD-induced activation of oncogenic signalling. In conclusion, either antagomiR-21 or INT-767 alone prevent NAFLD progression, with combined targeting more effectively preventing disease progression, thus embodying a putative therapeutic strategy for preventing NAFLD progression and NAFLD-associated HCC.
Description
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia
Keywords
Farnesoid X receptor G protein coupled receptor 5 Hepatocellular carcinoma INT-767 microRNA-21 Non-alcoholic fatty liver disease Teses de mestrado - 2021