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- Conceito de esbulhoPublication . Pedro, Catarina Filipa Paulino; Pissarra, Nuno AndradeO presente estudo visa chegar ao conceito de esbulho, na medida em que existe falta de consenso na qualificação dos factos como perturbação e/ou esbulho. Isto é, relativamente aos casos da vida corrente, ocorre alguma discordância, entre a doutrina, no momento de qualificar os factos. Tal circunstância parece resultar da abstração e da dificuldade de entender o conceito fornecido, que muitas vezes se torna de difícil aplicação. Assim, de forma a superar as dificuldades encontradas na aplicação do conceito fornecido pela doutrina, será importante a revisão do conceito de esbulho, anteriormente fornecido e, consequentemente, a criação de um conceito mais idóneo e mais ajustado à realidade, de forma a extinguir a discrepância no momento da aplicação do conceito de esbulho aos factos. No presente trabalho, procedeu-se à análise de alguns autores, de forma a chegar ao conceito de esbulho e, assim, indagar acerca do percurso de raciocínio realizado por estes. Considerando esta análise, existem maioritariamente duas posições: por um lado, a privação da posse ou do seu exercício, como a perda da posse e, por outro, a privação da coisa. Contudo, alguns autores pronunciam-se sobre o esbulho como a perda da posse efetiva. Posto isto, foi feita ainda a análise do ordenamento jurídico, incluindo os seus princípios, seguido do cruzamento entre este e as posições preconizadas pelos autores observados, de forma a captar a idoneidade das suas correntes doutrinárias. Após toda a observação e indagação, foi construído um novo percurso conceptual de acordo com uma nova linha de raciocínio. Assim, temos esbulho como a quebra do corpus possessório, proveniente de uma posse incompatível.
- Sobre a legitimidade do direito penal na violação da obrigação de alimentosPublication . Monjamba, Amadeu Fernando; Aguilar, FranciscoO presente estudo tem como objetivo fundamental, demonstrar se o Direito Penal tem legitimidade para intervir no âmbito da violação da obrigação de alimentos. A afirmação da legitimidade ou ilegitimidade, depende dá avaliação concreta de dois critérios, nomeadamente: a dignidade penal da conduta e a necessidade ou carência de tutela penal. Nota-se que o titular do direito a alimentos em caso de incumprimento da obrigação de alimentos, dispõe de dois meios para garantir o cumprimento da respetiva prestação, designadamente: a tutela civil, (através do mecanismo previsto no art.º 48º do RGPTC e da execução especial de alimentos, previsto no art.º 933.º e seguintes do CPC) e a tutela penal, (através do crime de violação da obrigação de alimentos, previsto no art.º 250.º do CP). Constatamos que o Direito Civil, em muitos domínios da violação da obrigação de alimentos apresenta-se como o meio mais adequado para tutelar a satisfação das necessidades fundamentais do alimentando. Por outro lado, a tutela penal através do crime de violação da obrigação de alimentos contraria o princípio da subsidiariedade ou da intervenção mínima, uma vez que o Direito Penal só deve intervir quando os outros ramos do Direito forem ineficazes de tutelar os bens jurídicos em causa. Portanto, o princípio da intervenção mínima surge como interrogação da legitimidade do Direito penal no âmbito da violação da obrigação de alimentos. Ou melhor, questiona-se se em caso da violação da obrigação de alimentos seria o Direito Penal o meio necessário para tutelar os interesses em causa, uma vez que o Direito Civil já tutela o mesmo instituto.
- Latest trends in sustainable food packaging filmsPublication . Júnior, Edilson Galdino Santos Silva; Silva, Isabel Alexandra Caldeira Ribeiro Monge da; Bettencourt, Ana Francisca de Campos SimãoA embalagem alimentar é atualmente a melhor forma de proteger os alimentos ao longo de toda a cadeia de abastecimento até ao consumidor, especialmente quando se trata de alimentos frescos. A sua utilização permite uma maior protecção contra danos físicos, deterioração e contaminação, para além de aumentar o tempo de conservação dos alimentos. Contudo, o sistema convencional de acondicionamento ainda coloca alguns problemas à indústria alimentar, como o desperdício de alimentos e a produção excessiva de plástico. O desperdício de alimentos é um problema causado por diversos factores (por exemplo, produção excessiva, contaminação e deterioração por microrganismos) e tem um impacto directo na economia e no ambiente. Além disso, o plástico é um dos materiais mais comumente utilizados em material de condicionamento alimentar, utilizado para proteger e prolongar o prazo de validade dos alimentos. Contudo, ao considerar a quantidade de plástico produzido pela sua indústria para atender às exigências atuais e ao seu impacto sobre o ambiente, encontramos uma relação não sustentável. Além disso, as embalagens convencionais de plástico não têm qualquer efeito na redução da contaminação por microrganismos. Tendo em conta o que foi anteriormente mencionado, um dos objectivos deste trabalho é discutir as recentes descobertas no desenvolvimento de películas de base biológica para embalagens alimentares, com potencial para substituir as películas convencionais à base de petróleo. Outro objetivo deste trabalho é explorar a potencial aplicação de tecnologias de manufatura aditiva, também conhecidas como "impressão 3D", e procurar avanços na produção de matéria-prima de origem biológica, e com potencial de aplicação no desenvolvimento de películas sustentáveis para acondicionamento alimentar. Para tal, foi realizada uma extensa revisão da literatura a fim de encontrar progressos nas áreas acima mencionadas. Pelos resultados, concluiu-se que existe uma diversidade de polímeros de origem natural, também conhecidos como “biopolímeros”, que são promissores no desenvolvimento de embalagens alimentares sustentáveis. Entre os polímeros de origem natural encontrados, destacam-se o quitosano, o ácido poliláctico, a celulose e derivados, o amido, as gomas e os polihidroxialcanos, que podem ser utilizados, de forma individual ou como mistura, para produzir películas de acondicionamento alimentar por diferentes metodologias. Além dos polímeros mencionados, destaca-se também o uso de compostos de origem natural, e. g. extratos naturais e óleos essenciais, que em conjunto com os biopolímeros, permitem o desenvolvimento de formulações de embalagens não apenas biodegradáveis e sustentáveis, mas também com propriedades ativas, tais como: atividade antibacteriana, antioxidante, sensibilidade às mudanças de pH e resistência à radiação ultravioleta. De forma semelhante, foram também encontrados progressos significativos na produção de matérias-primas à base de biopolímeros para as tecnologias de manufatura aditiva, assim como material de acondicionamento alimentar inovador produzido por esta tecnologia. Apesar dos poucos estudos encontrados, diretamente relacionados com a produção de embalagens alimentar, os resultados mostram que esta tecnologia pode de facto contribuir para avanços nesta área, sendo capaz de produzir filmes e outros materiais de acondicionamento alimentar de origem natural de forma mais eficiente que os métodos convencionais, otimizando assim o carácter “inteligente” e ativo da embalagem alimentar. No entanto, a falta de estudos sobre a utilização da impressão 3D, em conjunto com biopolímeros, na produção de filmes de acondicionamento alimentar sugere que esta tecnologia inovadora tem sido muito pouco explorada neste campo. Alguns factores que podem explicar a escassez de pesquisa nesta área incluem os elevados custos associados às tecnologias de manufactura aditiva, a falta de compatibilidade das tecnologias com os materiais de origem natural e a necessidade de desenvolver um número superior de misturas/formulações de biopolímeros com não só uma boa capacidade de impressão, mas também com propriedades que satisfaçam os critérios necessários para actuar como material de embalagem de alimentos. Considerando o progresso no desenvolvimento de matérias-primas naturais para a manufactura aditiva, bem como o seu potencial, é provável que no futuro esta tecnologia seja mais amplamente empregue no campo da embalagem de alimentos nomeadamente de filmes, o que poderá traduzir-se, juntamente como os crescentes avanços na produção de embalagens sustentáveis e inteligentes, não apenas numa redução na produção de plástico de origem fóssil, mas também a um consumo alimentar mais seguro.
- Development of hybrid molecules of anti-tumour triazenes that target iron metabolismPublication . Pires, André Filipe Neves Gonçalves Andrade; Perry, Maria De Jesus; Capela, RitaOs lisossomas são organelos celulares que contêm um vasto leque de enzimas capazes de hidrolisar proteínas, ADN (ácido desoxirribonucleico), polissacarídeos, carboidratos e lípidos. Deste modo, funcionam como se fossem o sistema digestivo da célula, degradando material que entra nas células por endocitose, bem como para digerir componentes celulares envelhecidos e obsoletos. Todas as enzimas lisossomais são hidrolases acídicas que estão ativas apenas a um pH acídico, de aproximadamente 5, que é mantido dentro destes organelos. Como consequência da sua função, os lisossomas acabam por degradar macromoléculas que contém ferro na sua constituição, como por exemplo a ferritina e acumulam por isso grandes quantidades de ferro no seu interior. Este ferro encontra-se ativo, ou seja, é capaz de realizar reações de oxidaçãoredução, conhecidas como reações de Fenton, aumentando assim a suscetibilidade dos lisossomas ao stress oxidativo. Aquando da digestão destas metaloproteínas, ocorre também libertação de ferro ativo para o exterior dos lisossomas. Uma vez no citoplasma da célula, o mesmo ferro, pode realizar reações de Fenton responsáveis por oxidar substratos orgânicos e organelos e por isso este fenómeno está associado ao processo de apoptose. No interior dos lisossomas, o ferro pode assumir outro papel, como por exemplo provocar a permeabilização da membrana lisossomal. A permeabilização da membrana lisossomal verifica-se acentuadamente na grande maioria das células cancerígenas que no seu interior possuem ferro em elevadas quantidades e é acompanhada por uma relocalização dos lisossomas para a periferia do citoplasma. Este movimento dos lisossomas em conjunto com a libertação das enzimas hidrolíticas, provocadas pela permeabilização da membrana dos lisossomas, para o citoplasma da célula é um mecanismo que ocorre em muitas células cancerígenas e é importante na progressão e metástase dos tumores. Para além das alterações a nível lisossomal, as células tumorais também apresentam alterações no metabolismo do ferro, por necessitarem de um maior e mais rápido aporte deste metal para o seu interior e assegurar o rápido crescimento e proliferação das mesmas. Deste modo, os lisossomas das células cancerígenas, que possuem uma elevada concentração de ferro no seu interior quando comparado com as células dos tecidos saudáveis, pode ser considerado como um potencial alvo terapêutico, pois pode ser possível obter um efeito citotóxico seletivo em células tumorais. v O desenvolvimento de moléculas híbridas é uma abordagem promissora na terapêutica anticancerígena. A combinação dos compostos com atividades diferentes e independentes num composto híbrido covalentemente ligado, funciona sinergicamente pelos efeitos de cada uma das partes, fornecendo uma potencia farmacológica maior do que a soma das potências individuais. Estes compostos híbridos podem combinar diferentes classes de pequenas moléculas. A ideia dos compostos híbridos surgiu das terapias combinadas que procuravam potenciar os efeitos de um só fármaco ou prevenir resistência aos fármacos. Os compostos híbridos para além destes objetivos procuram também melhorar os perfis farmacocinéticos, bem como a biodisponibilidade dos fármacos individuais, parâmetros de grande importância no desenho de fármacos. Para além disso, têm como potencial aumentar a eficácia, melhorar a segurança sendo também mais rentáveis. Um composto frequentemente utilizado na síntese de compostos híbridos tem sido a artemisinina. A artemisinina, é um conhecido fármaco para o tratamento da malária, no entanto alguns estudos reportam também a sua atividade antitumoral. Para desempenhar a sua função, a artemisinina tem de reagir com ferro no estado de oxidação (II), mais precisamente a sua ponte endoperoxídica. Esta reação leva à formação de radicais de carbono livres que no caso do tratamento da malária servem para alquilar proteínas fundamentais à sobrevivência do parasita responsável pela malária. No que diz respeito à atividade antitumoral, o mecanismo é semelhante. Na presença de ferro, que se encontra em grande concentração nas células tumorais, ocorre a ativação da ponte endoperoxídica com a formação dos respetivos radicais de carbono. Estes radicais, alquilam proteínas e substratos orgânicos fundamentais à sobrevivência das células cancerígenas, alquilam o ADN danificando-o, promovendo a apoptose destas células, reduzindo também o processo de angiogénese. Ao longo do tempo foram sintetizados derivados da artemisinina como o ácido artesúnico e a dihidroartemisinina que possuem também atividade anticancerígena. Os triazenos que são moléculas de cadeia linear compostas por três átomos de azoto, são uma diversa classe de compostos que têm sido estudados maioritariamente pela atividade anticancerígena potencial em muitos tipos de tumores como a leucemia o melanoma e os tumores cerebrais. A sua atividade antitumoral é baseada na formação de uma espécie de diazónio alquilante do ADN. São facilmente sintetizados através das respetivas anilinas sob condições acídicas e por intermédio da formação de um sal de diazónio que reage com uma amina primária ou secundária. Os triazenos com maior vi interesse clínico são os agentes alquilantes dacarbazina e temozolomida. O dacarbazina, derivativo carboxamida-imidazole está estruturalmente relacionado com as purinas e tem sido utilizado clinicamente para o tratamento do melanoma maligno, sarcoma dos tecidos moles e doença de Hodgkin. O temozolomida é um agente alquilante da classe das tetrazinas que é estruturalmente e funcionalmente semelhante ao dacarbazina. Apresenta uma boa distribuição no sistema nervoso central e foi primeiramente utilizado para o tratamento de tumores cerebrais como o glioblastoma multiforme, oligodendroglioma e mais tarde de metástases cerebrais de melanoma. Estes fármacos, no entanto, apresentam fatores farmacocinéticos que limitam a quantidade que atinge de facto o local de ação. Para além disso são pouco seletivos para as células tumorais induzindo invariavelmente toxicidade em tecidos saudáveis, uma grande barreira para o sucesso destas terapias. A conjugação dos triazenos com derivados da artemisinina, com a formação de um híbrido, pode melhorar as propriedades farmacocinéticas dos triazenos, reduzindo a toxicidade não específica, bem como melhorar a seletividade para as células tumorais onde o ferro se encontra em grande quantidade. Assim, este trabalho de investigação teve como objetivo a síntese de compostos híbridos, compostos por duas unidades: um triazeno (agente alquilante do ADN) e um derivado da artemisinina (composto que contém um endoperóxido capaz de ser ativado pelo ferro no seu estado de oxidação (II)), acoplados por uma ligação amida. A ligação amida foi escolhida pela sua grande estabilidade in vivo, podendo ser ativada lentamente através de hidrólise química ou enzimática, sendo um substrato para enzimas como as amidases. Para a síntese destes compostos híbridos, sintetizaram-se primeiro as duas moléculas a serem ligadas covalentemente. Assim, sintetizou-se numa primeira fase o derivado da artemisinina, ácido C10-Carba. Para se chegar a este derivado, realizaram-se as sínteses de outros derivados da artemisinina como a dihidroartemisinina, o derivado α-C10-Benzoato e o derivado β-C10-Alilo. Posteriormente sintetizou-se o triazeno pretendido, sob a forma de um monometiltriazeno, sintetizado a partir da respetiva anilina, passando pela síntese de um hidroximetiltriazeno. Depois de se obterem as respetivas moléculas, utilizaram-se duas metodologias diferentes para as acoplar recorrendo à ativação do ácido carboxílico presente no derivado da artemisinina. Estas metodologias baseiam-se na utilização dos agentes de acoplamento CDI/HOBt ou através da combinação DCC/HOBt. O método mais eficiente foi o DCC/HOBt, onde se obtiveram rendimentos entre os 15 e os 30%. Cada composto foi purificado por coluna vii cromatográfica e quando necessário por cromatografia preparativa. Cada composto foi também caracterizado estruturalmente por ressonância magnética nuclear mono e bidimensional, bem como por espetroscopia de massa e ultravioleta. Depois de caracterizados, foi avaliada a estabilidade de cada composto em tampão fosfato (pH=7.4) e em plasma humano, recorrendo a técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência. Os compostos híbridos sintetizados demonstram ser bastante estáveis em tampão fosfato (pH=7.4) bem como em plasma humano, sendo que neste último ensaio a estabilidade foi comparativamente menor, devido provavelmente à atividade enzimática plasmática. A estabilidade também foi avaliada em ensaios com microssomas de fígado de rato, onde se observou uma degradação dos compostos ao longo do tempo. Por fim, compararam-se as estabilidades dos diferentes ensaios, em plasma humano e tampão fosfato (pH=7.4) dos compostos sintetizados neste trabalho (C10-carba), com compostos sintetizados num trabalho anteriormente realizado (C10-oxo). Estes compostos diferem no linker entre o derivado da artemisinina e o triazeno. De forma generalizada, os compostos (C10-carba), apresentaram uma maior estabilidade em solução tampão fosfato (pH=7.4) e uma menor estabilidade em plasma humano, do que os compostos (C10-oxo). Foram também determinados valores de IC50, de modo a avaliar a atividade biológica em células tumorais e fizeram-se também comparações com os compostos (C10-oxo). Os compostos sintetizados demonstraram na sua maioria serem ativos, sendo que os compostos com os substituintes aromáticos, Cl, CH3 e CN apresentaram resultados promissores.
- Desenvolvimento de moléculas híbridas tendo como alvo a cadeia respiratória do Mycobacterium tuberculosisPublication . Canudo, Daniela Alexandra Oliveira; Lopes, Francisca da Conceição e Rocha; Saldanha, Maria de Jesus A. R. Perry da CâmaraA tuberculose (TB) é uma doença infeciosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Apesar do declínio na incidência e mortalidade desta doença, das inovações nos diagnósticos e na melhoria do acesso aos cuidados de saúde, o surgimento de infeções por micobactérias resistentes a fármacos constitui um dos maiores problemas de saúde pública. A emergência de estirpes do Mtb multi- e extensivamente resistentes a fármacos, a ausência de uma vacina eficaz e a duração do tratamento, tornam urgente o desenvolvimento de novos fármacos, nomeadamente fármacos que atuem em novos alvos terapêuticos e através de mecanismos de ação diferentes. Outra ameaça no controlo desta epidemia é a atual pandemia da COVID-19, pois acresce o potencial impacto a médio prazo no número de pessoas que desenvolvem TB a cada ano. A cadeia respiratória do Mtb tem sido considerada um novo alvo para o desenvolvimento de fármacos, em virtude do surgimento de compostos aprovados e em estudo, que têm como alvos componentes da sua cadeira respiratória, realçando a vulnerabilidade do metabolismo de energia desta micobactéria e a sensibilidade dos componentes da via da fosforilação oxidativa à inibição química específica. Esta dissertação teve como principal objetivo desenvolver compostos híbridos com estabilidades químicas diferentes. Estes compostos contêm na sua estrutura uma molécula base, a pirroloquinolona, ligada a um farmacóforo contendo o grupo nitro através de diferentes linkers. Foram desenvolvidos com o objetivo de serem capazes de atuar seletivamente sobre diferentes alvos da cadeia respiratória do agente infecioso Mtb, nomeadamente no complexo Cyt-bcc-aa3 (PYQ) e no Cyt- bd (libertação de NO), inibindo assim a síntese de ATP. Assim, espera-se que os compostos híbridos atuem tanto na forma ativa como na forma latente da doença. A síntese, caracterização estrutural e as propriedades físico-químicas e ADME dos compostos híbridos são apresentadas. A estabilidade dos compostos híbridos em condições fisiológicas, incluindo estabilidade em tampão fosfato, em plasma humano e em microsomas de fígado de rato, foi avaliada por HPLC. A avaliação da atividade antimicrobiana dos compostos híbridos (6a-b) e dos seus semelhantes sem o farmacóforo que contém o grupo nitro (5a-b) foi realizada através da determinação da concentração mínima inibitória por microdiluição em meio líquido. Verificou-se que a presença do farmacóforo contendo o grupo nitro originou um aumento da atividade dos compostos contra o Mtb, mostrando que os compostos híbridos são promissores no tratamento da TB. Estes ensaios revelaram que o composto híbrido 6a é o mais eficaz a inibir a espécie bacteriana Mtb.
- Targeting the adipose tissue to treat fatty liver: role of TGR5Publication . Silva, Daniela Filipa da; Castro, Rui Eduardo Mota; Rodrigues, Cecília Maria PereiraO fígado gordo não-alcoólico (FGNA) é uma condição cuja prevalência está a crescer globalmente e está a caminho de se tornar a principal causa de doença hepática crónica. De facto, é possível que se torne, também, uma das principais causas de transplantes hepáticos. Atualmente, estima-se que uma em cada quatro pessoas no mundo sofra de FGNA. Em termos da sua progressão, o FGNA está inicialmente associado à acumulação de gordura no fígado (esteatose), mas pode evoluir para características histológicas menos favoráveis, nomeadamente esteatohepatite não-alcoólica (EHNA), despoletada pela inflamação e associada ao desenvolvimento de fibrose. Numa fase mais avançada, pode também levar a um estadio de cirrose e, eventualmente, ao aparecimento de carcinoma hepatocelular. Além disso, a patogénese desta doença está intimamente ligada à resistência à insulina e à desregulação do normal funcionamento do tecido adiposo. Infelizmente, ainda não existem medidas terapêuticas eficazes que estejam aprovadas para o tratamento do FGNA. Desde modo, torna-se de extrema importância a descoberta e o estudo de opções de tratamento para esta patologia, já que também a prevalência da diabetes tipo 2 e da obesidade deverão aumentar nos próximos anos. Num estado de obesidade, a libertação de ácidos gordos e citoquinas pelo tecido adiposo branco encontra-se aumentada, principalmente quando a acumulação de gordura é potenciada no tecido adiposo visceral e quando a capacidade de “absorção” de ácidos gordos nos tecidos subcutâneos se esgota. Assim sendo, os ácidos gordos não acumulados no tecido adiposo podem causar danos no fígado, ao serem transportados pela veia porta até este órgão. No entanto, os adipócitos castanhos e bege, cuja formação tem lugar no tecido adiposo branco através de um processo denominado “browning”, estão a revolucionar a forma como o tecido adiposo é percecionado, uma vez que estas células tem a capacidade de transformar energia em calor, promovida pela proteína uncoupling protein 1 (UCP1), em vez de acumular gordura. Atualmente, existem vários estudos centrados na descoberta de fatores que consigam potenciar atividade dos adipócitos castanhos e a formação dos adipócitos beges; e também focados em perceber quais os mecanismos envolvidos. Neste contexto, foi demonstrado que os ácidos biliares parecem potenciar o funcionamento dos adipócitos castanhos e também o processo do “browning”, através da estimulação de recetores celulares, em particular o recetor Takeda G-protein coupled bile acid receptor (TGR5). O TGR5 é expresso em diferentes tipos celulares (p. e. adipócitos, macrófagos e enterócitos) mas pouco expresso em hepatócitos. A sua atividade pode ser promovida por ácidos biliares, com diferentes graus de atividade, mas também já surgiram agonistas sintetizados em laboratório. Para além de induzir o “browning”, a atividade do TGR5 também é reconhecida por melhorar a obesidade, diminuir a resistência à insulina, a esteatose e as respostas inflamatórias. Assim sendo, a atividade do TGR5 tem sido estudada como uma possível abordagem terapêutica para doenças metabólicas. Estudos recentes realçam o papel que as vesículas extracelulares (EVs) libertadas do tecido adiposo parecem exercer na perpetuação da obesidade, resistência à insulina e até no FGNA, ao serem internalizados pelos hepatócitos onde o seu conteúdo - lípidos, proteínas e microRNAs, entre outros, é libertado. De notar que, a origem e contexto em que surgem estas EVs podem ditar os seus efeitos funcionais noutros órgãos. Por exemplo, EVs com origem no tecido adiposo visceral poderão ser mais facilmente associadas a um efeito metabólico negativo quando introduzidas noutras células ou órgãos. Neste estudo, o objetivo global foi avaliar o papel funcional de EVs libertadas por adipócitos, na presença ou ausência de ativadores do TGR5, sobre células hepáticas num contexto de inflamação. Adipócitos 3T3-L1 diferenciados foram expostos a diferentes agonistas do TGR5, incluindo ácidos biliares. A ativação do TGR5 foi comprovada pelo aumento dos níveis de expressão da proteína de UCP1, bem como do próprio TGR5. Culturas enriquecidas em adipócitos diferenciados, usando a técnica Density-based separation followed by Replating of Enriched Adipocytes in Monolayer (DREAM), exibiram ativação de TGR5 ligeiramente aumentada. Em seguida, o meio de cultura das células onde se observou maiores níveis de ativação do TGR5 foram processados para isolamento de EVs. Em paralelo, hepatócitos humanos HepG2 foram tratados com LPS para induzir inflamação, confirmada pelo aumento da expressão de mediadores pro-inflamatórios, nomeadamente IL-8, IL-1β, TNF-α e CCL2. Por fim, a incubação de células HepG2 com EVs de adipócitos onde o TGR5 tinha sido ativado, uma hora antes da adição de LPS às culturas celulares, reduziu consideravelmente o aumento de citocinas inflamatórias em resposta a este estímulo inflamatório. O segundo objetivo foi usar ratinhos com deleção do TGR5 no tecido adiposo, alimentados com uma dieta indutora de FGNA, para avaliar em detalhe o papel da expressão e ativação do TGR5 no tecido adiposo, in vivo. Devido aos atrasos na obtenção dos ratinhos transgénicos a partir dos nossos colaboradores, assim como todas as outras restrições impostas pela pandemia da COVID-19, o modelo ainda não está concluído. No entanto, relatamos já as experiências de otimização inicial que foram realizadas, em particular a otimização da atividade Cre induzida por tamoxifeno e genotipagem. No geral, os nossos resultados sugerem que EVs de adipócitos com o TGR5 ativado contêm moléculas capazes de exercer uma função anti-inflamatória em hepatócitos. Resultados sobre o papel do TGR5 no tecido adiposo durante os diferentes estadios de FGNA, in vivo, serão críticos para estabelecer inequivocamente se a ativação do TGR5 no tecido adiposo comunica efeitos metabólicos ao fígado por meio da modulação do conteúdo de EVs. Uma vez que resultados recentes sugerem que os adipócitos podem regular o metabolismo por meio da libertação de exosomas contendo miRNAs, e uma vez que agonistas do TGR5 estão a ser avaliados em ensaios clínicos para o FGNA, os nossos resultados atuais e futuros poderão ter importantes implicações terapêuticas e elucidar circuitos de sinalização que integram alvos tangíveis para a prevenção, gestão e/ou tratamento da obesidade e FGNA.
- Exploring the neuroprotective role of miR-335 in experimental Parkinson's diseasePublication . Lúcio, Ana Cecília Moita do Rosário; Amaral, Joana; Rodrigues, CecíliaA doença de Parkinson (DP), a segunda doença neurodegenerativa mais comum, é impulsionada pela perda progressiva de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra e no estriado. A etiologia da DP é desconhecida, mas tanto fatores genéticos como ambientais parecem desempenhar um papel preponderante na patogénese da doença. Além disso, os microRNAs (miRNAs ou miRs) encontram-se frequentemente desregulados em doenças neurodegenerativas, incluindo na DP. Mais especificamente, resultados do nosso laboratório demonstraram que o miR-335 está significativamente diminuído em diferentes modelos experimentais que mimetizam a DP, bem como em doentes. Em termos de mecanismo, o miR-335 tem como alvo direto Leucin-rich repeat kinase 2 (LRRK2), cuja sobre-expressão tem sido associada a uma maior suscetibilidade para desenvolver a doença. Também demonstrámos que, em linhas celulares de microglia e neuronais. o miR-335 inibe a neuroinflamação induzida por estímulos inflamatórios clássicos, como lipopolisacáridos (LPS) e alfa-sinucleína, e até mesmo pela sobre-expressão de LRRK2. Com este trabalho, pretendemos investigar o potencial do miR-335 para aliviar a morte neuronal induzida por 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+), uma neurotoxina amplamente usada para mimetizar a DP in vitro. Como esperado, o tratamento de células SH-SY5Y de neuroblastoma humano com 2.5 mM MPP+ durante 48 h, induziu níveis significativos de morte celular determinados pela libertação de adenilato cinase (AK) e ensaios do metabolismo de MTS. Paralelamente, testámos no nosso modelo o potencial neuroprotetor do composto X. Curiosamente, os nossos resultados indicaram que o composto X, estruturalmente semelhante ao fármaco citoprotetor UDCA, mas de uma rota sintética diferente, foi capaz de proteger parcialmente as células da morte celular induzida por MPP+ e o seu efeito protetor foi mais acentuado do que no caso do UDCA e TUDCA. Além disso, estudos realizados fora do âmbito desta tese, também demonstraram a atividade antiapoptótica do composto X em outros tipos de células não neuronais e estímulos tóxicos, o que reforça ainda mais os nossos resultados. No futuro, estudos de otimização química devem ser realizados de forma a melhorar a atividade do composto X e torná-lo mais adequado para ensaios in vivo. Curiosamente, o inibidor geral de caspases, zVAD, reverteu os efeitos tóxicos da neurotoxina MPP+. Para melhor caracterizar o tipo de morte celular associada à toxicidade do MPP+, medimos a atividade e ativação das caspase-3 e -7, moléculas-chave para a execução da apoptose, que se verificaram estar aumentadas. A ativação da apoptose foi ainda confirmada pela avaliação da morfologia nuclear após a coloração com o marcador fluorescente Hoechst. Curiosamente, também descobrimos que a incubação concomitante de células com necrostatina-1 (Nec-1), um inibidor potente da necroptose, abolia a toxicidade mediada pelo MPP+ sugerindo assim um papel adicional para este tipo de morte celular regulada neste modelo. No entanto, nem a ferrostatina-1 nem a liproxstatina-1, fortes inibidores da ferroptose, demonstraram qualquer efeito protetor no nosso modelo, o que nos indica que possivelmente este tipo de morte celular não está a ocorrer, pelo menos nestas condições experimentais. É importante referir que quando transfectámos transitoriamente as células com um precursor específico do miR-335-3p (pre-miR-335-3p), 24 h antes da exposição ao MPP+, os níveis de morte celular diminuíram em comparação com as células transfectadas com um controlo negativo. No que diz respeito à necroptose, a exposição de células transfectadas com controlo negativo ao MPP+ resultou num aumento de 50% na razão entre a proteína MLKL fosforilada (pMLKL) e a sua forma total, e um aumento de 10 vezes na expressão de RIP3, no proteoma insolúvel das células, sugerindo assim a ativação de necroptose. Em contrapartida, o tratamento com MPP+ não alterou os níveis de RIP1, o que não invalida a existência de necroptose, porque estudos indicam que este tipo de morte celular pode ocorrer de forma independente da RIP1. Contudo, é curioso que a Nec-1, um inibidor da atividade cinase da RIP1, proteja as células da toxicidade provocada por MPP+. Podemos especular que estes efeitos resultam de atividades off-target da molécula. Em geral, os nossos resultados indicam um papel importante do miR-335 na proteção contra a morte celular induzida por MPP+. Enquanto que a morte celular por apoptose parece ser a via de sinalização induzida preferencialmente pela neurotoxina e o alvo do miR-335, os resultados da ativação da necroptose requerem confirmação adicional. Para caracterizar ainda mais o mecanismo de ação do miR-335 e porque a necroptose é um tipo de morte celular inflamatória, colocámos a hipótese de que a inibição da necroptose pelo miR-335 também poderia resultar na diminuição da inflamação. Uma característica marcante da DP é a neuroinflamação crónica caracterizada pela ativação microglial e níveis mais elevados de mediadores pró-inflamatórios. Por outro lado, o MPP+ parece promover a expressão dos marcadores pró-inflamatórios TNFα, COX-2 e NLRP3, em células SH-SY5Y. Em conjunto, os nossos resultados parecem sugerir um papel para o miR-335 na atenuação da inflamação associada ao MPP+ no nosso modelo; no entanto, são necessárias mais experiências para confirmar estas descobertas. A ativação da morte celular por piroptose também merece ser explorada no nosso modelo. Finalmente, seria interessante avaliar a ativação de vias de sinalização inflamatória clássicas, incluindo JNK, p38 e ERK1/2, bem como a ativação NF-κB, que é um mediador-chave na resposta inflamatória. Compreender a interação entre a diferentes vias de sinalização é essencial para a criação de novas e mais eficazes estratégias terapêuticas. Com este trabalho foi implementado e otimizado um modelo robusto para o estudo dos mecanismos de morte celular associados à DP, usando a linha celular de neuroblastoma humano, SH-SY5Y, exposta à neurotoxina MPP+, e contribuímos com novo conhecimento sobre o potencial neuroprotetor do miR-335 na patogénese desta doença. Em particular, avançámos com resultados in vitro que indicam que a sobre-expressão do miR-335 pode vir a traduzir-se numa abordagem terapêutica promissora e inovadora para travar a neurodegenerescência associada à DP, através da inibição da morte celular por apoptose e possivelmente necroptose, bem como da neuroinflamação.
- Narciso nas Metamorfoses de Ovídio e na pintura de J. W. WaterhousePublication . Severino, Carlos MesquitaDesde que começa a expor na Royal Academy of Arts, em 1874, até à sua morte, em 1917, J. W. Waterhouse manteve um relacionamento constante com os textos clássicos, nomeadamente com as Metamorfoses de Ovídio, com base nas quais produziu sete telas admiráveis e vários estudos. Uma dessas obras – Echo and Narcissus (1903; Walker Art Gallery, Liverpool; óleo sobre tela, 109 cm x 189 cm) – é a imagem mais reproduzida da galeria de Liverpool. De facto, ela foi pioneira na aquisição dos direitos de autor, quando a comprou ao artista na Liverpool Autumn Exhibition em 1903. Além deste trabalho, o pintor também usou a flor como motivo recorrente na sua pintura, designando Narcissus uma tela de 1912, cuja composição retrata um prado inglês florido. Propomo-nos analisar Echo and Narcissus, relacionando-o com o texto de Ovídio e, de seguida, estudar algumas das pinturas do artista que evocam a flor e a figura do mito.
- In vitro and in vivo evaluation of new hybrid molecules following its incorporation into a lipid-based nanosystem for melanoma managementPublication . Penetra, Maria João Maia; Gaspar, Maria Manuela; Amaral, Joana São José DiasO melanoma é um tipo de cancro muito agressivo, cuja incidência continua a aumentar, particularmente na Europa. Para além disso, conta também com um elevado número de mortes associadas, em particular no melanoma metastático. De entre as várias terapêuticas existentes para o seu tratamento, a cirurgia é a primeira opção para os estadios primários, revelando-se curativa. No entanto, em estadios mais avançados outras terapias são necessárias para uma boa gestão da doença, nomeadamente a terapêutica alvo, a imunoterapia e a quimioterapia. Todas estas terapias convencionais apresentam, no entanto, desvantagens, especialmente no melanoma metastático. Para além de algumas destas estratégias terapêuticas serem pouco seletivas para as células cancerígenas, estando na origem de efeitos secundários graves, os pacientes acabam também por desenvolver resistência aos tratamentos. Sendo o melanoma uma doença tão complexa, o recurso a terapias combinadas, está associado a uma maior eficácia terapêutica. No entanto, existe também o risco de interações medicamentosas e fármacos em concentrações sub-terapêuticas. Assim surgiu o conceito de moléculas híbridas, que por combinarem dois ou mais farmacóforos, possuem mais do que uma ação terapêutica, numa única molécula, superando, deste modo, algumas das dificuldades associadas ao uso de terapias combinadas. Neste sentido, diversas moléculas híbridas com atividade anti-melanoma foram desenvolvidas. Uma classe destes compostos, são os derivados do triazeno 4-mercaptofenol (TMD), os quais possuem ação dupla, conferida pela conjugação de dois diferentes tipos de farmacóforos, um análogo da tirosina, capaz de ser ativado pela tirosinase, a enzima que se encontra sobre-expressa nas células do melanoma, e derivados do triazeno, um agente alquilante de DNA. As células cancerígenas na presença destes compostos, através da oxidação do grupo fenol pela tirosinase, permitem a quebra da molécula e a libertação do grupo triazeno, que irá atuar ao nível do DNA celular. Por outro lado, na transposição destas moléculas para estudos in vivo, verifica-se muitas vezes que as mesmas apresentam eficácia terapêutica reduzida. Este efeito pode estar relacionado com várias características das moléculas, nomeadamente, baixa solubilidade, perfil de biodistribuição inadequado, degradação química antes do composto atingir as células alvo, e a interação com tecidos saudáveis, que está na origem de efeitos tóxicos. Com vista a ultrapassar todas estas dificuldades, a associação destas moléculas a sistemas de veiculação de fármacos, como os lipossomas, constitui uma alternativa promissora. Os lipossomas são constituídos por fosfolípidos, que na presença de água, formam vesículas, capazes de incorporar moléculas hidrofilicas, hidrófobas e anfipáticas. Para além de serem biocompatíveis, não tóxicos e não imunogénicos, os lipossomas conseguem melhorar o tempo em circulação dos compostos incorporados, prevenir interações não desejadas, reduzir a degradação enzimática dos compostos, promover um direcionamento para locais alvo, aumentando a concentração dos compostos nos tecidos ou órgãos afetados. Neste trabalho diversas moléculas TMD foram testadas, com vista a que uma delas, a mais promissora e com mais capacidades anti tumorais, fosse escolhida para ser testada num modelo murino de melanoma. Assim, após um screening in vitro das moléculas, diversos ensaios foram realizados, nomeadamente: distribuição do ciclo celular, Guava ViaCount, atividade das caspases 3/7 e a atividade hemolítica, em linhas celulares de melanoma, humanas e murinas. Os resultados obtidos foram satisfatórios, demonstrando que duas das moléculas, CTA10 e SM01, após os testes de screening, promoveram uma diminuição da viabilidade celular de células murinas de melanoma, impediram a progressão do ciclo celular para além das fase G0/G1, com uma diminuição simultaneamente das populações celulares na fase S do ciclo. Por outro lado, o ensaio das caspases apoptóticas 3/7, revelou que ambos os compostos, em concentrações sub-tóxicas, resultaram num aumento da atividade desta enzima relativamente ao controlo negativo e ao controlo positivo, células tratadas com dacarbazina (DTIC), um fármaco aprovado para o tratamento do melanoma. Com estes resultados satisfatórios, ambas as moléculas foram incorporadas em lipossomas que incluíram na sua composição PEG, conferindo assim propriedades de longo tempo de circulação na corrente sanguínea e potenciando, deste modo, a extravasão e acumulação nos locais tumorais. Os lipossomas foram preparados pelo método Desidratação-Re-hidratação, seguido de um passo de extrusão para reduzir e homogeneizar o tamanho médio dos lipossomas. As formulações lipídicas foram extensivamente caracterizadas, apresentando um diâmetro médio de 150 nm, uma superficial neutra, e eficiências de incorporação na ordem dos 90%. Testes de estabilidade em suspensão, a 4 ºC, das duas formulações foram também realizados. Estes revelaram que, 7 dias após a preparação das nanoformulações, mais de 65% das moléculas TMD incorporadas continuavam associadas aos lipossomas. Com base nos resultados in vitro, o composto mais promissor, que se foi destacando ao longos dos diferentes ensaios, foi escolhido para ser avaliado in vivo. O composto selecionado, na forma livre e lipossomal, foi testado em termos de atividade hemolítica, após incubação com eritrócitos de dadores saudáveis. As formulações não apresentaram atividade hemolítica (% de hemólise < 3%). A formulação escolhida foi seguidamente testada in vivo, em termos de segurança e atividade anti tumoral. Os testes in vivo de segurança foram realizados em murganhos C57BL/6 saudáveis, que foram durante 5 dias, injetados com o composto escolhido, na forma livre e lipossomal. Através da análise dos índices tecidulares e níveis das enzimas hepáticas, não foram observados efeitos tóxicos, demonstrando assim a segurança das formulações testadas. A avaliação da atividade anti tumoral, foi realizada num modelo murino de melanoma, através da administração subcutânea de células murinas B16F10. tumoral com uma injeção. Após as massas tumorais se tornarem palpáveis, o tratamento teve início e durante 7 dias os animais foram divididos em quatro grupos: grupo controlo, animais induzidos e não tratados, tratados com DTIC, ou com o composto na formas livre lipossomal. A progressão do tumor foi avaliada através da variação do volume da massa tumoral. Os animais tratados com a formulação lipossomal apresentaram uma progressão da massa tumoral mais baixa comparativamente a todos os outros grupos testados ao longo do esquema de tratamento. Para além disso, este grupo de animais apresentou também um valor médio das respetivas massas tumoral mais baixos, no final do tratamento. Com base nos índices tecidulares não foram verificadas diferenças entre os grupos em estudo. Para além disso, os níveis das enzimas hepáticas também não mostraram qualquer diferença entre os grupos experimentais e o controlo. De uma forma geral, a molécula TMD escolhida, para além de ser seletiva para a tirosinase, uma vez que um dos seus farmacóforos é um análogo do substrato desta enzima, e o outro apresenta propriedades citotóxicas, capazes de afetar o DNA celular. Os ensaios in vitro demonstraram a sua capacidade de reduzir a viabilidade celular de células tumorais, impedir a progressão do ciclo celular e aumentar a atividade de enzimas apoptóticas. Foi também demonstrada a segurança in vivo do composto para administração intravenosa. Para além disto, nos testes de eficácia terapêutica, num modelo murino de melanoma, a progressão das massas tumorais foi inferior comparativamente ao fármaco utilizado em clínica, o DTIC.
- The role of CDKs in co-transcriptional splicing through phosphorylation of the RNA Pol II carboxy-terminal domain (CTD)Publication . Cunha, Thais Souza; Prudêncio, Pedro António Pereira; Rodrigues, Cecília Maria PereiraO processo de transcrição, no qual uma molécula de ácido ribonucleico (ARN) é produzido a partir de uma cadeia de ácido desoxirribonucleico complementar a ela, é caracterizado por diversas etapas em que envolvem centenas de proteínas e outros fatores constituídos por RNA. Por esse processo os genes se expressam e assim constituem os componentes celulares e teciduais formadores do organismo, além de darem origem às enzimas, elementos envolvidos nas reações necessárias ao funcionamento dos seres vivos. Ao longo do processo transcricional, o transcrito enquanto é polimerizado também passa por processamentos, os quais modificam a sequência e a constituição do mesmo. Algumas dessas edições podem ocorrer após a transcrição ser finalizada, mas o acoplamento do processamento à transcrição traz vantagens como a diminuição do tempo requerido entre um estímulo parece iniciar a expressão de um gene e o produto final dessa expressão estar pronto e disponível para executar sua função. Nesse sentido, o Domínio carboxi-terminal (do inglês CTD) da ARN polimerase II (Pol II) faz o acoplamento entre o processamento do ARN e a transcrição. O CTD assemelha se a uma cauda que se alonga a partir da maior subunidade da Pol II que não só serve de suporte aos fatores envolvidos na transcrição como também ativamente os recruta devido às modificações pós translacionais aos quais são submetidos os aminoácidos que o constituem. Esse domínio é, na verdade, composto por várias repetições da sequência Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. Sabe-se razoavelmente como esses aminoácidos e suas isoformas modificadas, geralmente fosforiladas, influenciam o processo transcricional e o processamento do ARN. No entanto, no que diz respeito ao splicing co-transcricional são poucas as informações a esse respeito. Foi reportado que a maquinaria envolvida no splicing parece estar ligada a Ser5 fosforilada quando Pol II foram imunoprecipitadas com o uso de anticorpos para essa serina e ligada as polimerases foram encontrados 5’ intermediários da primeira reação de transesterificação do splicing. Também foi reportado que em células de Drosophila, ao se fazer uso da técnica de NET-seq observou-se que a polimerase se encontrava a curta distância de onde uma região em que um intron havia sido excisado quando os investigadores fizeram uso de anti-Ser5P. Neste trabalho hipotetizamos que a Ser5 fosforilada contribui para a ocorrência de splicings ainda próximos a Pol II em elongamento. Para testar se de fato a isoforma fosforilada dessa serina desempenha esse papel, decidimos inibir as cinases responsáveis pela fosforilação das mesmas (Cinase Dependentes de Ciclinas, do inglês CDKs) a fim de averiguar se essa inibição causa uma mudança nas dinâmicas do splicing co-transcricional. Primeiramente, selecionamos inibidores farmacológicos desenvolvidos em células humanas para usarmos em células de Drosophila com o intuito de evitar a fosforilação da Ser5 do CTD. Infelizmente, nenhum dos inibidores foi capaz de impedir que a Ser5 fosse fosforilada. Provavelmente, a razão para tal foi a incapacidade dos inibidores de se ligarem ao sítio ativo das cinases. Apesar de tanto as CDKs humanas quanto as de Drosophila apresentarem considerável similaridade na sua sequência de aminoácidos, a pequena diferença de aminoácidos entre as CDKs deve ser suficiente para que os inibidores não consigam se ligar as de Drosophila. Apesar de não ser nosso objetivo, conseguimos prevenir a fosforilação específica da Ser2 em Drosophila quando da inibição da CDK12. Diante do postulado, resolvemos mudar a estratégia e escolhemos o método Auxin-Inducible Degron (AID) para depletar de forma rápida as CDKs. Com esse método adicionamos uma tag a proteína alvo, e quando for conveniente, aplicamos auxina ao meio de cultura para que a mesma possa induzir a proteína à ubiquitinação seguida da degradação da própria. Antes que isso possa ser realizado, é necessário introduzir a tag no local devido dentro do genoma de Drosophila. Para tanto, selecionamos um protocolo desenvolvido para adição de sequências na porção N-terminal de genes de Drosophila utilizando a ferramenta CRISPR/Cas9. Essa técnica faz uso da extensão sobreposta de primers para produzir um guia curto de 19 nucleotídeos com a sequência correspondente ao local onde se deve criar uma quebra dupla no ADN, e um constructo formado de braços de homologia que flanqueiam a AID tag para servir de molde para o reparo por recombinação homóloga (RH). Em nossa primeira tentativa, apesar de termos conseguido produzir os guias e os constructos de RH para todas as três cinases transcricionais que queremos depletar, CDK7, CDK9 e CDK12, não obtivemos sucesso ao transfectar nossas células. Nos constructos também está incluída uma sequência que promove resistência ao antibiótico Blasticidina e que deveria servir para selecionar apenas as células em que a tag havia sido corretamente inserida no genoma. No entanto, ainda que as células tivessem se mostrado resistentes ao antibiótico, ao analisarmos se houve de fato inserção dos construtos no genoma por PCR, percebemos que as tags não estavam presentes na porção N-terminal das CDKs. Esses resultados nos levam a crer que uma possível inserção dos constructos em locais não específicos dentro do genoma das Drosophilas permitiu que essas células apresentassem resistência. Em uma posterior segunda tentativa, e após termos mudados a linha celular usada (S2 ao invés de DMEL) e termos substituído o agente de transfecção por FuGENE® HD, conseguimos inserir a AID-tag na porção desejada da CDK9. Por não termos tido mais tempo para inserir a tag nas demais CDKs, não foi possível estimular a degradação das mesmas pela indução com auxina. A fim de que possamos utilizar o método Degron futuramente para depletar as CDKs, alguns aspectos do método precisam ser revistos e melhorados. Visto que as células apresentaram resistência ao antibiótico Blasticidina apesar de o constructo não ter sido inserido no local desejado, isso nos leva a crer que talvez tenha havido uma inserção em outro lugar do genoma devido a falha em impedir a ocorrência de união de extremidades não homólogas (NHEJ em inglês). Uma solução possível pode ser aumentar a concentração de lig4 e mus308. Entretanto, enquanto ainda estávamos tentando inibir ou depletar as cinases transcricionais, repetidamente preparamos livrarias obtidas a partir do procedimento de NET-seq. Com essa técnica é possível detectar o transcrito nascente ainda acoplado a Pol II e sequenciá-lo com alta resolução os nucleotídeos nele presentes. Os protocolos disponíveis sobre a versão dessa técnica que faz uso de anticorpos para diversos perfis de fosforilação do CTD foram descritos para células de mamíferos (mNET-seq) ou embriões de Drosophila (dNET-seq). Apesar de similar em alguns pontos, o protocolo usado para essa dissertação teve de ser adaptado para células de Drosophila em cultura (DMEL). Para tanto, fizemos ensaios para testar a melhor concentração e tempo de digestão da enzima MNase. Também testamos diferentes concentrações de anticorpo e avaliamos a quantidade de beads necessária para a imunoprecipitação de Pol II. Tínhamos predito para esse trabalho a partir do uso do NET-seq, perceber mudanças nas pausas típicas para a Pol II downstream da 3’ SS como também alterações nas dinâmicas de splicing ao impedir a fosforilação de Ser5. No entanto, apesar de termos focado em uma possível correlação entre a ser5P e splicing, a técnica de Degron combinada ao NET-seq pode vir a ser utilizada para estudar o envolvimento de diversos fatores e o comportamento do Pol II CTD durante outros processos co-transcricionais como corte e adição da cauda poli(A). Portanto, acreditamos que a junção dessas duas técnicas pode vir a ser bastante útil no descobrimento de relações ainda pouco exploradas no que diz respeito às modificações pós-traducionais do CTD e a formação e edição do transcrito nascente.