Development of hybrid molecules of anti-tumour triazenes that target iron metabolism

Pires, André Filipe Neves Gonçalves Andrade

http://hdl.handle.net/10451/54533

Use this identifier to reference this record.

Name:	Description:	Size:	Format:
TM_André_Pires.pdf		3.64 MB	Adobe PDF	Download

Send Feedback

Authors

Pires, André Filipe Neves Gonçalves Andrade

Advisor(s)

Perry, Maria De Jesus

Capela, Rita

Abstract(s)

Os lisossomas são organelos celulares que contêm um vasto leque de enzimas capazes de hidrolisar proteínas, ADN (ácido desoxirribonucleico), polissacarídeos, carboidratos e lípidos. Deste modo, funcionam como se fossem o sistema digestivo da célula, degradando material que entra nas células por endocitose, bem como para digerir componentes celulares envelhecidos e obsoletos. Todas as enzimas lisossomais são hidrolases acídicas que estão ativas apenas a um pH acídico, de aproximadamente 5, que é mantido dentro destes organelos. Como consequência da sua função, os lisossomas acabam por degradar macromoléculas que contém ferro na sua constituição, como por exemplo a ferritina e acumulam por isso grandes quantidades de ferro no seu interior. Este ferro encontra-se ativo, ou seja, é capaz de realizar reações de oxidaçãoredução, conhecidas como reações de Fenton, aumentando assim a suscetibilidade dos lisossomas ao stress oxidativo. Aquando da digestão destas metaloproteínas, ocorre também libertação de ferro ativo para o exterior dos lisossomas. Uma vez no citoplasma da célula, o mesmo ferro, pode realizar reações de Fenton responsáveis por oxidar substratos orgânicos e organelos e por isso este fenómeno está associado ao processo de apoptose. No interior dos lisossomas, o ferro pode assumir outro papel, como por exemplo provocar a permeabilização da membrana lisossomal. A permeabilização da membrana lisossomal verifica-se acentuadamente na grande maioria das células cancerígenas que no seu interior possuem ferro em elevadas quantidades e é acompanhada por uma relocalização dos lisossomas para a periferia do citoplasma. Este movimento dos lisossomas em conjunto com a libertação das enzimas hidrolíticas, provocadas pela permeabilização da membrana dos lisossomas, para o citoplasma da célula é um mecanismo que ocorre em muitas células cancerígenas e é importante na progressão e metástase dos tumores. Para além das alterações a nível lisossomal, as células tumorais também apresentam alterações no metabolismo do ferro, por necessitarem de um maior e mais rápido aporte deste metal para o seu interior e assegurar o rápido crescimento e proliferação das mesmas. Deste modo, os lisossomas das células cancerígenas, que possuem uma elevada concentração de ferro no seu interior quando comparado com as células dos tecidos saudáveis, pode ser considerado como um potencial alvo terapêutico, pois pode ser possível obter um efeito citotóxico seletivo em células tumorais. v O desenvolvimento de moléculas híbridas é uma abordagem promissora na terapêutica anticancerígena. A combinação dos compostos com atividades diferentes e independentes num composto híbrido covalentemente ligado, funciona sinergicamente pelos efeitos de cada uma das partes, fornecendo uma potencia farmacológica maior do que a soma das potências individuais. Estes compostos híbridos podem combinar diferentes classes de pequenas moléculas. A ideia dos compostos híbridos surgiu das terapias combinadas que procuravam potenciar os efeitos de um só fármaco ou prevenir resistência aos fármacos. Os compostos híbridos para além destes objetivos procuram também melhorar os perfis farmacocinéticos, bem como a biodisponibilidade dos fármacos individuais, parâmetros de grande importância no desenho de fármacos. Para além disso, têm como potencial aumentar a eficácia, melhorar a segurança sendo também mais rentáveis. Um composto frequentemente utilizado na síntese de compostos híbridos tem sido a artemisinina. A artemisinina, é um conhecido fármaco para o tratamento da malária, no entanto alguns estudos reportam também a sua atividade antitumoral. Para desempenhar a sua função, a artemisinina tem de reagir com ferro no estado de oxidação (II), mais precisamente a sua ponte endoperoxídica. Esta reação leva à formação de radicais de carbono livres que no caso do tratamento da malária servem para alquilar proteínas fundamentais à sobrevivência do parasita responsável pela malária. No que diz respeito à atividade antitumoral, o mecanismo é semelhante. Na presença de ferro, que se encontra em grande concentração nas células tumorais, ocorre a ativação da ponte endoperoxídica com a formação dos respetivos radicais de carbono. Estes radicais, alquilam proteínas e substratos orgânicos fundamentais à sobrevivência das células cancerígenas, alquilam o ADN danificando-o, promovendo a apoptose destas células, reduzindo também o processo de angiogénese. Ao longo do tempo foram sintetizados derivados da artemisinina como o ácido artesúnico e a dihidroartemisinina que possuem também atividade anticancerígena. Os triazenos que são moléculas de cadeia linear compostas por três átomos de azoto, são uma diversa classe de compostos que têm sido estudados maioritariamente pela atividade anticancerígena potencial em muitos tipos de tumores como a leucemia o melanoma e os tumores cerebrais. A sua atividade antitumoral é baseada na formação de uma espécie de diazónio alquilante do ADN. São facilmente sintetizados através das respetivas anilinas sob condições acídicas e por intermédio da formação de um sal de diazónio que reage com uma amina primária ou secundária. Os triazenos com maior vi interesse clínico são os agentes alquilantes dacarbazina e temozolomida. O dacarbazina, derivativo carboxamida-imidazole está estruturalmente relacionado com as purinas e tem sido utilizado clinicamente para o tratamento do melanoma maligno, sarcoma dos tecidos moles e doença de Hodgkin. O temozolomida é um agente alquilante da classe das tetrazinas que é estruturalmente e funcionalmente semelhante ao dacarbazina. Apresenta uma boa distribuição no sistema nervoso central e foi primeiramente utilizado para o tratamento de tumores cerebrais como o glioblastoma multiforme, oligodendroglioma e mais tarde de metástases cerebrais de melanoma. Estes fármacos, no entanto, apresentam fatores farmacocinéticos que limitam a quantidade que atinge de facto o local de ação. Para além disso são pouco seletivos para as células tumorais induzindo invariavelmente toxicidade em tecidos saudáveis, uma grande barreira para o sucesso destas terapias. A conjugação dos triazenos com derivados da artemisinina, com a formação de um híbrido, pode melhorar as propriedades farmacocinéticas dos triazenos, reduzindo a toxicidade não específica, bem como melhorar a seletividade para as células tumorais onde o ferro se encontra em grande quantidade. Assim, este trabalho de investigação teve como objetivo a síntese de compostos híbridos, compostos por duas unidades: um triazeno (agente alquilante do ADN) e um derivado da artemisinina (composto que contém um endoperóxido capaz de ser ativado pelo ferro no seu estado de oxidação (II)), acoplados por uma ligação amida. A ligação amida foi escolhida pela sua grande estabilidade in vivo, podendo ser ativada lentamente através de hidrólise química ou enzimática, sendo um substrato para enzimas como as amidases. Para a síntese destes compostos híbridos, sintetizaram-se primeiro as duas moléculas a serem ligadas covalentemente. Assim, sintetizou-se numa primeira fase o derivado da artemisinina, ácido C10-Carba. Para se chegar a este derivado, realizaram-se as sínteses de outros derivados da artemisinina como a dihidroartemisinina, o derivado α-C10-Benzoato e o derivado β-C10-Alilo. Posteriormente sintetizou-se o triazeno pretendido, sob a forma de um monometiltriazeno, sintetizado a partir da respetiva anilina, passando pela síntese de um hidroximetiltriazeno. Depois de se obterem as respetivas moléculas, utilizaram-se duas metodologias diferentes para as acoplar recorrendo à ativação do ácido carboxílico presente no derivado da artemisinina. Estas metodologias baseiam-se na utilização dos agentes de acoplamento CDI/HOBt ou através da combinação DCC/HOBt. O método mais eficiente foi o DCC/HOBt, onde se obtiveram rendimentos entre os 15 e os 30%. Cada composto foi purificado por coluna vii cromatográfica e quando necessário por cromatografia preparativa. Cada composto foi também caracterizado estruturalmente por ressonância magnética nuclear mono e bidimensional, bem como por espetroscopia de massa e ultravioleta. Depois de caracterizados, foi avaliada a estabilidade de cada composto em tampão fosfato (pH=7.4) e em plasma humano, recorrendo a técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência. Os compostos híbridos sintetizados demonstram ser bastante estáveis em tampão fosfato (pH=7.4) bem como em plasma humano, sendo que neste último ensaio a estabilidade foi comparativamente menor, devido provavelmente à atividade enzimática plasmática. A estabilidade também foi avaliada em ensaios com microssomas de fígado de rato, onde se observou uma degradação dos compostos ao longo do tempo. Por fim, compararam-se as estabilidades dos diferentes ensaios, em plasma humano e tampão fosfato (pH=7.4) dos compostos sintetizados neste trabalho (C10-carba), com compostos sintetizados num trabalho anteriormente realizado (C10-oxo). Estes compostos diferem no linker entre o derivado da artemisinina e o triazeno. De forma generalizada, os compostos (C10-carba), apresentaram uma maior estabilidade em solução tampão fosfato (pH=7.4) e uma menor estabilidade em plasma humano, do que os compostos (C10-oxo). Foram também determinados valores de IC50, de modo a avaliar a atividade biológica em células tumorais e fizeram-se também comparações com os compostos (C10-oxo). Os compostos sintetizados demonstraram na sua maioria serem ativos, sendo que os compostos com os substituintes aromáticos, Cl, CH3 e CN apresentaram resultados promissores.

Lysosomes are acidic vacuolar organelles whose main function is the degradation under certain conditions, of intra- and extracellular components, using hydrolases capable of provoking the scission of nucleic acids, proteins, carbohydrates, and lipids, by processes of autophagy and heterophagy/phagocytosis. By degrading damaged or no longer functioning biomolecules or organelles, lysosomes contribute to cellular homeostasis. Furthermore, lysosomes are organelles that are involved in processes closely related to cancer development and progression. This can be seen in cancer cells where the lysosomes of the cancer cells are displaced to their periphery. When Ferritin is saturated with iron due to an excess of it, or when other proteins containing this metal are degraded in the lysosomes, iron capable of redox reactions is released. These reactions make the lysosome membrane susceptible to peroxidation and rupture because of oxidative stress. Following this rupture, the lysosomal enzymes and iron are released into the cytoplasm, causing even more damage in a continuous oxidative stress environment, and triggering the development of diseases such as cancer. Artemisinin is a sesquiterpene lactone, whose most accepted mechanism is based on the homolytic cleavage of its peroxidic bridge dependent on free Fe2+. It is mostly known for its use in malaria treatment; however, it has been demonstrated that artemisinin also shows anticancer properties. Triazenes like temozolomide or dacarbazine, are anticancer drugs used for the treatment of tumours. Their therapeutic action is based on the alkylating capacity on DNA bases. In this work we present the synthesis of hybrid drugs, containing the artemisinin pharmacophore linked to a triazene scaffold that selectively target enriched iron lysosomes, leading to a selective and toxic effect in tumoural cells. The synthesis of the hybrid compounds was carried out using different methodologies based on the activation of a carboxylic acid for subsequent coupling with a secondary amine. The most efficient method was the use of DCC/HOBt, with yields obtained between 15 and 30%. The stability in phosphate buffer (pH = 7.4) and human plasma was evaluated by high-performance liquid chromatography and the hybrid compounds proved to be stable. Comparisons were made between the stabilities of the compounds synthesized in this iii work with some analogues synthesized in a previous work, to determine which are more stable, considering the structural change that differentiates them. Finally, the biological activity of the hybrid compounds was also evaluated, with the aim of comparing their activities with those previously synthesized. To this end, the determination of IC50 was performed. The synthesized compounds were mostly shown to be active, with the compounds with the aromatic substituents, Cl, CH3 and CN showing promising results.