DMF - Teses de Doutoramento
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- Análise da função de Delta4 na regulação da angiogénese embrionária e neo-angiogénese tumoralPublication . Trindade, Alexandre José Neto; Duarte, António José de Freitas; Costa, Luís Filipe Lopes daO correcto desenvolvimento dos embriões de metazoários segmentados depende do desenvolvimento de um sistema vascular sanguíneo, um processo regulado a vários níveis. Este passo do desenvolvimento embrionário passa por vários eventos morfogenéticos, que resultam na conversão funcional de células progenitoras, responsivas a factores pró-angiogénicos, em redes complexas de vasos sanguíneos, que cobrem todo o organismo e acompanham o crescimento do embrião. O desenvolvimento do sistema vascular é um processo dinâmico, em que as células endoteliais integram continuamente sinais de expansão e amadurecimento da rede vascular. A presença de sinais conflituosos resulta num sistema altamente dinâmico, que responde rapidamente às necessidades mas que não se expande desnecessariamente. Existem várias vias de sinalização que estão envolvidas na regulação da remodelação do sistema vascular embrionário. Neste trabalho avaliou-se a importância de Dll4, um ligando da via de sinalização Notch, neste papel. Produziram-se linhas de ratinhos transgénicos com sobre-expressão condicional de dll4, que revelaram um papel importante deste gene na determinação da identidade endotelial arterial e na indução de quiescência e maturação do sistema vascular. Neste sentido, Dll4 reduz o perfil migratório das células endoteliais, inibe a formação de novas ramificações vasculares, estimula o recrutamento de células de músculo liso, aumenta a produção de matriz extracelular, aumenta a adesão celular homotípica e reduz a proliferação endotelial. Este papel é conseguido, pelo menos parcialmente, por Dll4, através da via Notch, actuar de forma negativa sobre o funcionamento de vias pró-angiogénicas, como a via VEGF e Wnt. A análise da função de Dll4 no desenvolvimento da vasculatura tumoral confirmou o papel anti-angiogénico deste gene. Os resultados revelaram que o bloqueio do funcionamento deste gene resulta numa vasculatura hiper-ramificada, mas hipo-perfundida, que não suporta o crescimento tumoral. Este facto sustenta a hipótese do controlo do funcionamento de Dll4 apresentar potencial terapêutico na luta contra o cancro.
- Distribuição nuclear, dinâmica e função das topoisomerases I, IIα e IIβ na replicação de genomas : estudo experimental no adenovírus serótipo 2-Publication . Ferreira, Fernando António da Costa; Ferreira, João António Augusto; Fonseca, Maria de Carmo S. V. R.Neste trabalho foi estudado o papel das topoisomerases celulares (I, IIα e IIβ) na replicação, usando os adenovírus como modelo. Os adenovírus apresentam um genoma de ADN de cadeia dupla e são responsáveis por infecções respiratórias, gastro-intestinais, oftalmológicas, neurológicas e genito-urinárias. São organismos ubiquitários, infectam passáros e a maioria dos mamíferos, incluindo o Homem. Com efeito, a importância destes vírus tem vindo a aumentar por surgirem associados a novos quadros nosológicos (imunodeficiências, transplantes de órgãos) e por poderem vir a funcionar como vectores terapêuticos em doenças genéticas e na viroterapia do cancro. No presente trabalho (1) analisámos a distribuição das topoisomerases I, IIα e IIβ no núcleo de células infectadas, com utilização de tecnologias modernas de microscopia, (2) caracterizámos funcionalmente os locais de acumulação destas enzimas, (3) testámos se a replicação e a transcrição virais eram necessárias ao seu recrutamento, (4) estudámos a dinâmica das topoisomerases I e IIα in vivo por FRAP, (5) realizámos a analise mutacional da topoisomerase I e (6) quantificámos as concentrações e actividades catalíticas das topoisomerases antes e depois da infecção. Por fim, (7) abordámos a conexão funcional entre estas proteínas celulares e a replicação do vírus por depleção selectiva de cada topoisomerase (siRNA), evitando os efeitos genotóxicos dos fármacos antitopoisomerase. Os resultados obtidos permitem concluir que ambos os tipos de topoisomerases (I e II) são utilizados pelo adenovírus durante a sua replicação, mas que o seu papel é diferencial, com relevo inesperado para as topoisomerases IIα e IIβ. Estes resultados sugerem que as topoisomerases poderão ser potenciais alvos na terapêutica de patologias infecciosas e potenciais factores preditivos na terapêutica viral do cancro.
- Células Mato na retina : caracterização morfológica e funcional de uma nova população de células perivasculares autofluorescentes em situação fisiológica e de retinopatiaPublication . Jorge, Maria Luísa Mendes; Pina, José António Rebocho Esperança; Ruberte París, JesúsA retina contém diferentes populações celulares derivadas dos monócitos: macrófagos perivasculares e células da micróglia. Neste trabalho, descreve-se a presença de um novo subtipo de macrófagos residentes, distintos das células da micróglia, localizados no espaço perivascular, em retinas humanas e de murganho. Estas células emitem uma fluorescência específica e expressam constitutivamente receptores scavenger da classe A. Exibem um movimento alternado constante, ao longo dos vasos sanguíneos, providenciando um revestimento adicional a áreas mais delgadas da parede vascular. Para além disso, acumulam peroxidase de rábano e lipoproteínas de baixa densidade acetiladas em circulação, sem rotura da barreira hemato-retiniana. No conjunto, estes resultados sugerem que estas células, com função scavenger, contribuem para o funcionamento da barreira hemato-retiniana. Acumulam, também, ferro, em lisossomas, provavelmente por um mecanismo de endocitose de ferritina, mediada por receptores TIM-2, sugerindo o seu envolvimento na homeostasia do ferro na retina e em situações de alteração desta. Em fases iniciais de degenerescência dos fotorreceptores, estas células migram para o local das lesões, sugerindo a sua participação nos processos de retinopatia. Todos estes aspectos são semelhantes aos descritos para as células Mato cerebrais. Por conseguinte, este estudo estabelece, pela primeira vez, a presença de células Mato na retina.
- Contribution to the study of lipid composition and nutritional value of intramuscular fat in ruminant meatsPublication . Alfaia, Cristina Maria Riscado Pereira Mateus; Prates, José António Mestre; Castro, Matilde Fonseca eContribuição para o estudo da composição lipídica e do valor nutricional da gordura intramuscular na carne de ruminantes - A composição em ácidos gordos e o ácido linoleico conjugado (CLA) são temas actuais de grande interesse, com particular relevância para a qualidade da carne e saúde humana. As carnes de ruminantes têm sido consideradas alimentos pouco saudáveis, principalmente devido à sua fracção lipídica com elevada concentração em ácidos gordos saturados. Contudo, as gorduras edíveis dos ruminantes são a principal fonte natural de isómeros CLA, sendo os isómeros bioactivos (c9,t11 e t10,c12) associados a propriedades potencialmente benéficas para a saúde humana. Em Portugal, a informação científica disponível para apoiar a qualidade e a reputação da carne bovina de raças autóctones criadas segundo as especificações de Denominação de Origem Protegida (DOP) continua restrita. Para além disso, os dados disponíveis não permitem ter uma percepção global de como distintos factores influenciam a composição da carne, desde a sua produção até ao consumo. Neste contexto, a nossa investigação foi desenvolvida estudando o efeito dos regimes alimentares dos animais (pastagem×concentrado), processamento tecnológico da carne após o abate (irradiação) e tratamentos térmicos (fervura, microondas e grelhagem), no perfil lipídico, especialmente nos isómeros do CLA, e no valor nutricional de carne de ruminantes. Foram seleccionadas e caracterizadas 4 carnes tradicionais DOP (Carnalentejana, Mertolenga, Barrosã e Arouquesa). Os resultados sugerem que a gordura intramuscular das carnes de novilho relativamente às de vitela, apresentam menor valor nutricional ao longo do ano, devido ao sistema de produção semi-extensivo utilizado nos novilhos. Por sua vez, a Carnalentejana-DOP apresenta uma qualidade nutricional superior comparativamente à carne de vaca de produção intensiva. No sentido de avaliar em detalhe o efeito de diferentes regimes alimentares no valor nutricional dos lípidos da carne, bem como a sua utilidade como discriminantes químicos da origem da carne, realizou-se um ensaio controlado. Os dados obtidos reforçam os resultados anteriores que sugeriam que a carne de animais de pastoreio apresenta melhor qualidade nutricional (teores mais elevados de n-3 PUFA e CLA) do que a carne de animais alimentados a concentrado. Este facto traduz os efeitos benéficos da pastagem no perfil de ácidos gordos da carne. Relativamente às alterações na composição da gordura intramuscular, resultantes do efeito de processamentos seguintes ao abate, a irradiação, uma tecnologia prospectiva para a conservação das carnes, não promoveu modificações significativas. Os tratamentos térmicos, frequentemente utilizados em culinária, induziram um impacto moderado no perfil dos ácidos gordos, como consequência das perdas de humidade e concentração da gordura. Em resumo, a composição lipídica da gordura intramuscular das carnes de bovino DOP estudadas apresenta um valor nutricional acrescentado para os consumidores, considerando os valores de n-3 PUFA, CLA (total e do isómero c9,t11) e da razão n-6/n-3, contribuindo para a sua diferenciação no mercado.
- New insights into biological effects of conjugated linoleic acid and saturated fats in body fat composition, obesity and related disorders: experimental studies in normal-weight Wistar and obese Zucker ratsPublication . Martins, Susana Isabel Vargas; Prates, José António Mestre; Castro, Matilde da Luz dos Santos Duque Fonseca eThe daily intake of conjugated linoleic acid (CLA) isomers by humans, through diet and supplementation, and the controversial effects of these compounds in human health, were the main motivation for the elaboration of this thesis. Firstly, the present work intended to estimate the daily CLA ingestion by the Portuguese population. Secondly, the biological effects of CLA were exploited using two distinct animal models, normal-weight (Wistar rat) and genetically fat (obese Zucker rat), in combination with saturated fat based diets. The estimative of total CLA intake for the Portuguese population was 73.70 mg/day. The cis(c)9,trans(t)11 and t7,c9 were the most prevalent CLA isomers, with, respectively, 76.10 and 12.56% of the total CLA intake value. Concerning the animal trials, CLA in conjugation with saturated fats revealed beneficial but also deleterious biological effects. In the normal-weight Wistar rat fed a palm oil based diet, the administration of c9,t11 CLA isomer increased the serum triacylglycerols and the size of adipocytes from epididymal and retroperitoneal fat depots. In addition, a CLA mixture of c9,t11 and t10,c12 isomers increased the glycerol membrane permeability of kidney proximal tubules, which may indicate an improvement of glycerol reabsorption pathway. In the obese Zucker rat, CLA (as a mixture) induced changes in fatty acid profile of liver, muscle and adipose depots. CLA supplemented with a vegetable saturated fat diet seemed to promote a more beneficial adipokine serum profile and an alleviation of hepatic steatosis. In contrast, adverse effects of CLA were observed with hypercholesterolaemia promotion. Regardless CLA, the ovine fat diets worsened the insulin resistance and increased the pro-inflammatory serum cytokines. In the liver, different levels of cell death and apoptotic pathways were modulated by CLA, depending on the type of saturated fat present in the diet. The most striking result of this study was that CLA was not able to promote fat loss in both experimental models. Moreover, new mechanisms of CLA action were disclosed in this work, which reinforce the need to further investigate this compound.
- Structure and function relationships in novel cellulosomal enzymes and cohesindockerin complexesPublication . Brás, Joana Luís Armada; Fontes, Carlos Mendes Godinho de Andrade; Prates, José António MestrePlant cell walls are the most abundant source of organic carbon on earth, providing an extraordinary supply of energy for various microorganisms. The energetic constrains posed by anaerobic ecosystems lead to the evolution of highly efficient multi-enzymatic complexes, termed cellulosomes, which orchestrate the deconstruction of structural carbohydrates. Clostridium thermocellum cellulosome has been extensively studied as the bacterium exhibits one of the highest growth rates on cellulose. Cellulosomes are assembled by a large non-catalytic multi-modular scaffoldin which contains repeated type I cohesins. Type I dockerin modules, usually located at the C-terminus of enzymes, bind tenaciously to type I cohesins. Scaffoldins may contain a type II dockerin which specifically recognizes type II cohesins located at the cell envelope, allowing the cell surface attachment of cellulosomes. Here a combination of methodologies was applied to study the structure and function relationships of novel cellulosomal enzymes and cohesin-dockerin complexes. Innovative molecular biology and biochemical protocols that can be applied to crystallize and solve the structure of cohesin-dockerin complexes are described in chapter 2. In addition, the crystal structures of two novel type I cohesin-dockerin complexes (CtCohOlpC-Doc124A and CtCohOlpA-Doc918) are described here. They revealed that the two dockerins are unusual since they lack the structural symmetry that supports the dual binding mode typical of type I modules. Thus, these dockerins present a single binding mode and seem to bind preferentially to cohesins located at the bacterium cell surface and not to cellulosomes (chapter 3). Doc124A is the dockerin of CtCel124A, an endoacting cellulase with a superhelical fold that acts in synergy with the major cellulosomal exo-cellulase, Cel48S, during cellulose hydrolysis. The crystal structure of CtCel124A in complex with two cellotriose molecules suggests that the enzyme may target the interface between crystalline and amorphous cellulose (chapter 5). In addition, the structure of a novel type II cohesin-dockerin complex (CtCohScaC2-XDocCipB) was solved. The functional importance of specific dockerin residues was determined. Type II dockerins are suggested to present two different cohesin-binding faces that express different specificities (chapter 4). Finally, the crystal structure of a penta-modular cellulosomal protein (CtXyl5A), previously of unknown function, was assessed (chapter 6). This protein is one of the largest cellulosomal components and comprises a GH5, two CBMs from families 6 and 13, a fibronectin type III-like module, a CBM from family 62 and a type I dockerin. CtGH5 has a canonical (α/β)8-barrel fold and displays specificity for arabinoxylans and as such, is defined as an arabinoxylanase. CtCBM6 adopts a β-sandwich fold and displays affinity for the reaction products generated by CtGH5 and for undecorated xylooligosaccharides. In addition, the penta-modular structure revealed a great flexibility for the CtCBM62 domain.
- Spatiotemporal study of morpho-functional modifications on cell nucleus during African swine fever virus infectionPublication . Simões, Margarida Pires; Ferreira, Fernando António da Costa; Martins, Carlos Manuel Lopes VieiraStudies on virus-host interactions are decisive to enhance our understanding on how African swine fever virus (ASFV) subverts cellular mechanisms, and also to better characterize host nucleus changes enabling this infection. Immunofluorescence studies and immunoblotting analysis of ASFV-infected cells, allowed us to identify the Ataxia telangiectasia mutated and Rad3-related (ATR) pathway as the specific DNA damage response (DDR) mechanism activated by ASFV infection. Additionally, the use of ATR kinase-dead cells confirmed that ATR has an essential role for the infection success. The viral intranuclear replication was then pursued using BrdU-pulse experiments, supported on previous reports about ASFV genome presence inside the host nucleus and the proven ATR activation. BrdU-labelled DNA molecules confirmed the active viral replication at early infection times, exclusively within the cell nucleus. Related spatial and morphological nuclear changes during ASFV infection were further addressed, particularly on subnuclear domains and host chromatin epigenetic signatures. Promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML-NBs), nuclear speckles and Cajal bodies displayed major alterations, accompanied by a repressive nuclear environment. PML knockdown revealed an essential proviral activity for ASFV successful infection. Herein, suggestions on how this work may help in the development of therapeutic strategies against ASFV infections can be found.
- Clinical and molecular characterization of feline mammary carcinomas overexpressing HER2 proto-oncogene (FMC-HER2+) : new strategies for effective diagnostic and cancer therapyPublication . Silva, Maria João da Costa Soares da; Ferreira, Fernando António Costa; Correia, Jorge Manuel de JesusConsidering the scarce data available in feline mammary carcinoma (FMC) and despite its importance in veterinary clinical practice, this thesis emerges in order to increase the knowledge of this tumor type, especially the FMC-HER2 positive. In the first two studies, the protocols for detection and quantification of the fHER2 and Ki-67 biomarkers were optimized and validated. These studies demonstrated that, in cats, the incidence of fHER2 overexpression were similar to women (about 30%), although no gene amplification was detected. It was also demonstrated that high levels of Ki-67 index were associated with a worse prognosis. Using a panel of protein biomarkers, the FMC were divided into six different groups that demonstrated prognostic value, similarly to what is described in women. In fact, cats with triple negative basal-like or HER2-positive subtypes were associated with shorter overall survival, contrasting with cats presenting luminal A tumors. Moreover, these studies also indicated that luminal B and triple negative basal-like subtypes are the most common in cats. When the metastatic lesions were evaluated, a marked loss of receptor expression was found, which was associated with an increase of the triple negative basal-like subtype, highlighting the importance of immunophenotyping all lesions (primary and metastatic) in cats. Considering these results, the development of diagnostic methodologies that allows the continuous follow-up of the patients would be very useful. Therefore, the last study presented in this thesis evaluates the fHER2 serum levels in cats with FMC using two different immunoassays (ELISA and dot blot). The serum levels of fHER2 were significantly associated with the fHER2 in tissue samples of FMC (assessed by IHC). This is consistent to what is described for humans and suggests that serum quantification could be an important tool for monitoring cats after the surgery. In sum, the results presented herein provide new diagnostic and prognostic tools for veterinary oncology. Considering the high prevalence and similarities with the human counterpart, cat can also represent a potential animal model for the study of luminal B and triple negative subtypes. Considering fHER2-positive FMC more studies are required in order to determine the aetiology of the protein overexpression.
- Portable “lab-on-chip” platform for bovine mastitis diagnosis in raw milkPublication . Duarte, Carla Margarida Pinheiro Cardoso; Bexiga, José Ricardo Dias; Freitas, Paulo Jorge Peixeiro deBovine mastitis is an economic burden for farmers mostly because of decreased milk yield, premature culling and cost of veterinary treatments. The identification of mastitis pathogens is of major importance in order for adequate control measures to be taken, to reduce the risk of appearance of chronic infections, and to target antimicrobial therapy. The aim of this study was to develop and validate a sensitive method for magnetic detection of Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis in raw milk samples. Mastitic milk samples were collected aseptically from 81 cows with subclinical mastitis, from 12 Portuguese dairy farms. Ninety one quarter milk samples were selected based on bacteriological results. All samples were submitted to PCR analysis. In parallel, these milk samples were mixed with a solution combining specific antibodies and magnetic nanoparticles, to be analyzed using a lab-on-a-chip magnetoresistive cytometer, with microfluidics sample handling. This immunological recognition was able to detect bacterial presence above 100 cfu/ ml, depending on antibody and targeted bacteria. Comparison with PCR results showed sensitivities of 73% and 41%, specificity values of 25% and 57%, and PPV values of 35% and 54% for magnetic identification of streptococci species with an anti-S. agalactiae antibody and an anti-GB Streptococcus antibody, respectively. Regarding staphylococci species, the sensitivity values found were of 57.1% and 79.3%, specificities of 75% and 50%, and PPV values of 40% and 95.8% for magnetic identification with an anti-S. aureus antibody and an anti-Staphylococcus spp. antibody, respectively. Both bacterial genus studies translated a fair expectation for a “cow-side” use application, making this integrated platform of potential use after further improvements for fast bacteriological infection screening. Some constraints are described as well as the method´s limitations in bacterial quantification.
- Utilização de murganhos no estudo de novos alvos da terapia oncológica anti-angiogénicaPublication . Carvalho, Catarina Isabel Cruz de; Duarte, António José de Freitas; Ferreira, Fernando António da CostaA angiogénese é um dos marcos do desenvolvimento tumoral, sendo fundamental para o crescimento do tumor primário e para a metastização. A terapia oncológica antiangiogénica surgiu como uma estratégia promissora. Contudo, o aparecimento de tumores que não são sensíveis, o desenvolvimento de resistência e a controvérsia sobre o impacto na metastização, tem suscitado apreensão na utilização desta abordagem terapêutica. Importa por isso esclarecer qual o impacto da anti-angiogénese na metastização e desenvolver novas abordagens terapêuticas anti-angiogénicas ou melhorar as existentes, identificando a melhor fase da progressão tumoral para intervir. Recentemente a terapia anti-Dll4 foi confirmada como uma ferramenta viável na luta contra o cancro. Todavia, importa ainda esclarecer o seu efeito no aporte tumoral de fármacos citostáticos e no processo metastático, o que permitirá consolidar a validação deste ligando como um alvo terapêutico útil e promissor. Compreender melhor os mecanismos moleculares implicados no desenvolvimento vascular embrionário permitirá a identificação de novos alvos terapêuticos. A Tspan18, uma molécula ainda pouco estudada, parece desempenhar funções pró-angiogénicas, mas o seu papel na angiogénese mamífera ainda não foi elucidado. Utilizando um modelo murino transgénico de adenocarcinoma prostático, o TRAMP, verificámos que a combinação de uma terapia anti-angiogénica, o sDll4Fc, com um citostático, a doxorrubicina, conduziu a uma marcada redução do volume tumoral melhorando simultaneamente a concentração do citostático no estroma tumoral. O modelo de metastização experimental com células de melanoma murino B16-F10 permitiu-nos verificar uma redução do número de focos metastáticos pulmonares nos murganhos heterozigóticos para Dll4 especificamente no endotélio. A produção de uma nova linha de murganhos com perda-defunção condicional e induzível da Tspan18 não foi possível, pelo que não conseguimos investigar o papel desta molécula na angiogénese.