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Publication
Structure and function relationships in novel cellulosomal enzymes and cohesindockerin complexes
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 15.62 MB | Adobe PDF |
Authors
Abstract(s)
Plant cell walls are the most abundant source of organic carbon on earth, providing an extraordinary
supply of energy for various microorganisms. The energetic constrains posed by anaerobic
ecosystems lead to the evolution of highly efficient multi-enzymatic complexes, termed cellulosomes,
which orchestrate the deconstruction of structural carbohydrates. Clostridium thermocellum
cellulosome has been extensively studied as the bacterium exhibits one of the highest growth rates on
cellulose. Cellulosomes are assembled by a large non-catalytic multi-modular scaffoldin which
contains repeated type I cohesins. Type I dockerin modules, usually located at the C-terminus of
enzymes, bind tenaciously to type I cohesins. Scaffoldins may contain a type II dockerin which
specifically recognizes type II cohesins located at the cell envelope, allowing the cell surface
attachment of cellulosomes. Here a combination of methodologies was applied to study the structure
and function relationships of novel cellulosomal enzymes and cohesin-dockerin complexes. Innovative
molecular biology and biochemical protocols that can be applied to crystallize and solve the structure
of cohesin-dockerin complexes are described in chapter 2. In addition, the crystal structures of two
novel type I cohesin-dockerin complexes (CtCohOlpC-Doc124A and CtCohOlpA-Doc918) are
described here. They revealed that the two dockerins are unusual since they lack the structural
symmetry that supports the dual binding mode typical of type I modules. Thus, these dockerins
present a single binding mode and seem to bind preferentially to cohesins located at the bacterium
cell surface and not to cellulosomes (chapter 3). Doc124A is the dockerin of CtCel124A, an endoacting
cellulase with a superhelical fold that acts in synergy with the major cellulosomal exo-cellulase,
Cel48S, during cellulose hydrolysis. The crystal structure of CtCel124A in complex with two cellotriose
molecules suggests that the enzyme may target the interface between crystalline and amorphous
cellulose (chapter 5). In addition, the structure of a novel type II cohesin-dockerin complex
(CtCohScaC2-XDocCipB) was solved. The functional importance of specific dockerin residues was
determined. Type II dockerins are suggested to present two different cohesin-binding faces that
express different specificities (chapter 4). Finally, the crystal structure of a penta-modular cellulosomal
protein (CtXyl5A), previously of unknown function, was assessed (chapter 6). This protein is one of the
largest cellulosomal components and comprises a GH5, two CBMs from families 6 and 13, a
fibronectin type III-like module, a CBM from family 62 and a type I dockerin. CtGH5 has a canonical
(α/β)8-barrel fold and displays specificity for arabinoxylans and as such, is defined as an
arabinoxylanase. CtCBM6 adopts a β-sandwich fold and displays affinity for the reaction products
generated by CtGH5 and for undecorated xylooligosaccharides. In addition, the penta-modular
structure revealed a great flexibility for the CtCBM62 domain.
RESUMO - Estrutura e função de novas enzimas celulossomais e de novos complexos coesina-doquerina - A parede celular vegetal constitui uma das principais fontes de carbono do planeta, sendo por isso um extraordinário recurso energético para muitos microrganismos. As limitações energéticas características dos ecossistemas anaeróbios conduziram à evolução de complexos multi-enzimáticos de elevada eficiência, denominados celulossomas, os quais coordenam a degradação dos hidratos de carbono da parede celular vegetal. O Clostridium thermocellum produz um celulossoma relativamente bem caracterizado já que a bactéria apresenta uma das maiores taxas de crescimento em celulose. A organização do celulossoma é efectuada por uma proteína não-catalítica multi-modular. Esta proteína de integração possui uma série de módulos repetidos, denominadas coesinas do tipo I. Na extremidade C-terminal das enzimas celulosomais existem módulos doquerina do tipo I, os quais se ligam fortemente às coesinas do tipo I. As proteínas de integração celulossomal podem conter ainda uma doquerina do tipo II que reconhece especificamente coesinas do tipo II localizadas no envelope celular permitindo, assim, a fixação dos celulossomas à superfície da bactéria. No presente trabalho foram desenvolvidas várias metodologias inovadoras com o intuito de determinar a estrutura e a função de novas enzimas celulossomais e de novos complexos coesina-doquerina. Os protocolos de biologia molecular e bioquímicos aqui descritos (capítulo 2) permitem ultrapassar as dificuldades inerentes à cristalização e, por conseguinte, à resolução da estrutura de complexos coesina-doquerina. Com base nestas metodologias, foram elucidadas as estruturas tridimensionais de dois novos complexos coesina-doquerina do tipo I (CtCohOlpCDoc124A e CtCohOlpA-Doc918). A análise destas estruturas revelou que as suas doquerinas são atípicas, uma vez que não possuem a simetria estrutural característica dos módulos doquerina do tipo I que lhes confere um modo de ligação duplo. Com efeito, estas novas doquerinas apresentam um modo de ligação simples e parecem ligar-se preferencialmente a coesinas localizadas na superfície da bactéria (capítulo 3). A Doc124A é a doquerina da CtCel124A, uma endo-celulase que possui um enrolamento super-helicoidal e que atua em sinergia com a principal exo-celulase celulossomal, a Cel48S, na hidrólise da celulose. A estrutura tridimensional da CtCel124A em complexo com duas moléculas de celotriose sugere que a enzima pode ter como substrato alvo a interface entre as formas cristalina e amorfa da celulose (capítulo 5). Para além da elucidação destas estruturas, foi também resolvida a estrutura de um novo complexo coesina-doquerina do tipo II (CtCohScaC2-XDocCipB). Os resultados sugerem que as doquerinas do tipo II apresentam duas interfaces de ligação a coesinas que expressam diferentes especificidades (capítulo 4). Por último, é apresentada a estrutura tridimensional de uma proteína celulossomal penta-modular (CtXyl5A) e é elucidada a sua função (capítulo 6). Esta proteína é um dos componentes celulossomais de maiores dimensões e compreende uma GH5, dois módulos de ligação a hidratos de carbono (CBMs) das famílias 6 e 13, um módulo de fibronectina do tipo III, um CBM da família 62 e ainda uma doquerina do tipo I. A GH5 apresenta um enrolamento canónico em barril (α/β)8 e possui especificidade para os arabinoxilanos, tendo sido por isso definida como uma arabinoxilanase. O CBM6 apresenta um enrolamento em β-sanduiche e possui afinidade para os produtos de reação gerados pela GH5 e para xilo-oligossacáridos nãodecorados. A estrutura penta-modular desta proteína revelou uma grande flexibilidade no domínio CBM62.
RESUMO - Estrutura e função de novas enzimas celulossomais e de novos complexos coesina-doquerina - A parede celular vegetal constitui uma das principais fontes de carbono do planeta, sendo por isso um extraordinário recurso energético para muitos microrganismos. As limitações energéticas características dos ecossistemas anaeróbios conduziram à evolução de complexos multi-enzimáticos de elevada eficiência, denominados celulossomas, os quais coordenam a degradação dos hidratos de carbono da parede celular vegetal. O Clostridium thermocellum produz um celulossoma relativamente bem caracterizado já que a bactéria apresenta uma das maiores taxas de crescimento em celulose. A organização do celulossoma é efectuada por uma proteína não-catalítica multi-modular. Esta proteína de integração possui uma série de módulos repetidos, denominadas coesinas do tipo I. Na extremidade C-terminal das enzimas celulosomais existem módulos doquerina do tipo I, os quais se ligam fortemente às coesinas do tipo I. As proteínas de integração celulossomal podem conter ainda uma doquerina do tipo II que reconhece especificamente coesinas do tipo II localizadas no envelope celular permitindo, assim, a fixação dos celulossomas à superfície da bactéria. No presente trabalho foram desenvolvidas várias metodologias inovadoras com o intuito de determinar a estrutura e a função de novas enzimas celulossomais e de novos complexos coesina-doquerina. Os protocolos de biologia molecular e bioquímicos aqui descritos (capítulo 2) permitem ultrapassar as dificuldades inerentes à cristalização e, por conseguinte, à resolução da estrutura de complexos coesina-doquerina. Com base nestas metodologias, foram elucidadas as estruturas tridimensionais de dois novos complexos coesina-doquerina do tipo I (CtCohOlpCDoc124A e CtCohOlpA-Doc918). A análise destas estruturas revelou que as suas doquerinas são atípicas, uma vez que não possuem a simetria estrutural característica dos módulos doquerina do tipo I que lhes confere um modo de ligação duplo. Com efeito, estas novas doquerinas apresentam um modo de ligação simples e parecem ligar-se preferencialmente a coesinas localizadas na superfície da bactéria (capítulo 3). A Doc124A é a doquerina da CtCel124A, uma endo-celulase que possui um enrolamento super-helicoidal e que atua em sinergia com a principal exo-celulase celulossomal, a Cel48S, na hidrólise da celulose. A estrutura tridimensional da CtCel124A em complexo com duas moléculas de celotriose sugere que a enzima pode ter como substrato alvo a interface entre as formas cristalina e amorfa da celulose (capítulo 5). Para além da elucidação destas estruturas, foi também resolvida a estrutura de um novo complexo coesina-doquerina do tipo II (CtCohScaC2-XDocCipB). Os resultados sugerem que as doquerinas do tipo II apresentam duas interfaces de ligação a coesinas que expressam diferentes especificidades (capítulo 4). Por último, é apresentada a estrutura tridimensional de uma proteína celulossomal penta-modular (CtXyl5A) e é elucidada a sua função (capítulo 6). Esta proteína é um dos componentes celulossomais de maiores dimensões e compreende uma GH5, dois módulos de ligação a hidratos de carbono (CBMs) das famílias 6 e 13, um módulo de fibronectina do tipo III, um CBM da família 62 e ainda uma doquerina do tipo I. A GH5 apresenta um enrolamento canónico em barril (α/β)8 e possui especificidade para os arabinoxilanos, tendo sido por isso definida como uma arabinoxilanase. O CBM6 apresenta um enrolamento em β-sanduiche e possui afinidade para os produtos de reação gerados pela GH5 e para xilo-oligossacáridos nãodecorados. A estrutura penta-modular desta proteína revelou uma grande flexibilidade no domínio CBM62.
Description
Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas
Keywords
Cellulosome Clostridium thermocellum cohesin dockerin glycoside hydrolase carbohydrate-binding module Celulossoma coesina doquerina glicósido hidrolase módulos de ligação a hidratos de carbono
Pedagogical Context
Citation
Brás, J.L.A. (2012). Structure and function relationships in novel cellulosomal enzymes and cohesindockerin complexes. Tese de Doutoramento. Universidade Técnica de Lisboa, Faculdade de Medicina Veterinária, Lisboa.
Publisher
Universidade Técnica de Lisboa. Faculdade de Medicina Veterinária