TRANSLAÇÃO DA SINALIZAÇÃO RIPK3 PARA APLICAÇÃO NA DOENÇA HEPÁTICA METABÓLICA

Funder

Organizational Unit

Publications

Targeting Colorectal Cancer Stem Cells via ferroptosis, a potential immunogenic cell death

Publication . David, Jan Caira Cruz; Afonso, Marta Bento; Rodrigues, Cecília Maria Pereira

O cancro colorretal (CRC) é uma doença agressiva com elevada incidência e mortalidade em todo o mundo. Apesar dos avanços no diagnóstico e terapia, a recorrência e as metástases são comuns, principalmente devido à existência de células estaminais cancerígenas (CSCs). Tal apela à descoberta de novos fármacos, que induzam vias de morte celular alternativas nas CSCs do CRC, para o seu uso em combinações terapêuticas. Assim, tivemos como objetivo validar três compostos previamente selecionados de uma triagem fenotípica para inibidores de CSCs no CRC e caraterizar a sua citotoxicidade. As linhas celulares HT29 e HCT116 foram plaqueadas a baixa densidade, utilizando meio para não-diferenciação e em condições de baixa adesão, para promover a formação de esferas enriquecidas em CSCs. A morte e a viabilidade celular foram avaliadas através de ensaios bioquímicos, seguidos do estudo de marcadores de morte celular, estaminalidade e diferenciação por qPCR e immunoblotting. A eficácia dos compostos foi validada in vivo em modelos de xenotransplante de HT29 à dose de 10 mg/kg i.p., três vezes por semana. Os nossos resultados revelam que os compostos foram tanto ou mais eficazes do que a salinomicina no impedimento da formação e crescimento das esferas colorretais enriquecidas em CSCs. Apesar das inconsistências na expressão de marcadores de estaminalidade/diferenciação, os compostos reduziram a viabilidade celular de esferas tumorais de células HT29 e HCT116, concomitante com um aumento da libertação extracelular de ATP, um damage associated molecular pattern bem estabelecido. A co-incubação com inibidores de morte celular revelou que os compostos induzem uma combinação de apoptose, necroptose e ferroptose em ambas as linhas celulares. Estes resultados foram apoiados pela modulação de marcadores característicos de apoptose e necroptose pelos compostos, nomeadamente caspase-3/7, PARP-1 e MLKL. Além disso, a indução de ferroptose em esferas tumorais de HCT116 foi corroborada pela alteração dos níveis proteicos de SLC7A11, GPx4, FTH1 e ALOX5, proteínas envolvidas no metabolismo do ferro e na peroxidação lipídica. Por fim, dois compostos foram bem tolerados e inibiram o crescimento tumoral in vivo, para além de modularem a expressão proteica dos principais marcadores de morte celular. Em conclusão, com este estudo descobrimos novos inibidores de CSCs de CRC que activam vários tipos de morte celular regulada com potencial imunogenicidade. Em particular, demonstrámos que a eliminação de CSCs colorretais por ferroptose poderá constituir uma estratégia para superar a resistência à morte celular em cancro.

2022-12-07Master thesis

Open access

Abordagem terapêutica no carcinoma hepatocelular

Publication . Mendes, Ana Margarida Bravo; Rodrigues, Cecília Maria Pereira

O carcinoma hepatocelular é o principal cancro primário do fígado, cujo desenvolvimento ocorre, maioritariamente, em contexto de cirrose hepática. Apesar da implementação de medidas preventivas e de vigilância, é expectável que o número de novos casos e mortes continue a aumentar na próxima década. A complexidade do carcinoma hepatocelular reflete ainda a dificuldade em definir uma estratégia terapêutica adequada a cada indivíduo. Contudo, existem ferramentas que permitem estabelecer um prognóstico e definir a estratégia terapêutica, em função do estadio tumoral, função hepática e estado geral do indivíduo. Na presente monografia pretende-se abordar as terapêuticas atualmente disponíveis para o tratamento do carcinoma hepatocelular, que têm vindo a alterar o paradigma terapêutico desta doença. De referir, no entanto, que o diagnóstico é geralmente realizado numa fase avançada da doença, como resultado do aparecimento tardio dos sintomas, dificultando o sucesso do tratamento. A evolução no panorama terapêutico do carcinoma hepatocelular é notória, uma vez que, atualmente, vários fármacos com diferentes mecanismos de ação estão aprovados para o tratamento do carcinoma hepatocelular em estadio avançado. Destacam-se aqui abordagens terapêuticas de primeira linha, como a associação de atezolizumab com bevacizumab, considerada a primeira opção terapêutica, durvalumab em associação com tremelimumab, sorafenib, o primeiro fármaco aprovado para o tratamento do carcinoma hepatocelular, e lenvatinib. Entre as opções terapêuticas de segunda e terceira linhas, incluem-se o regorafenib, ramucirumab e cabozantinib. Apesar dos avanços observados, as atuais opções terapêuticas disponíveis são limitadas e não alcançam os objetivos terapêuticos desejados, uma vez que se observam elevadas taxas de mortalidade. Considerando o dinamismo desta área e o facto de o carcinoma hepatocelular apresentar um dos prognósticos mais reservados, é fundamental o investimento e desenvolvimento de novos estudos e ensaios clínicos, que permitam avaliar novos potenciais regimes terapêuticos, capazes de maximizar a resposta clínica, bem como reduzir as taxas de recidiva e prolongar a sobrevivência.

2023-11-22Master thesis

Open access

The role of necroptotic extracellular vesicles in NAFLD pathogenesis

Publication . Campino, Gonçalo Marques de Sousa; Afonso, Marta Bento; Rodrigues, Cecília Maria Pereira

As vesículas extracelulares (EVs), envolvidas na comunicação intercelular e a necroptose, uma via de necrose regulada, cuja maquinaria facilita o tráfico endosomal e a geração de EVs, foram recentemente implicadas na patogénese de fígado gordo não alcoólico (NAFLD). Neste trabalho tivemos como objetivo caracterizar o papel funcional da maquinaria necroptótica na geração de EVs provenientes de hepatócitos (Hep-EVs) e o seu impacto na função dos hepatócitos com sobrecarga lípidica. Hep-EVs foram isoladas por precipitação a partir de células AML12 wild-type (WT), deficientes em Ripk3 e em Mlkl na presença ou ausência de 125 µM ácido palmítico (PA) durante 24h, sendo depois caracterizadas por immunoblotting e análise de rastreamento de nanoparticulas. De seguida, após 1h de pré-exposição a 10 µg/mL Hep-EVs, os hepatócitos foram incubados com 125 µM PA por 48h, seguido de avaliação da morte celular e do metabolismo lípidico. Os nossos resultados mostram que a incubação com PA aumenta a secreção de Hep-EVs, um fenótipo que é dependente da maquinaria necroptótica. Em contraste com os hepatócitos Mlkl-/-, os hepatócitos Ripk3-/- estiveram protegidos da morte celular provocada pelo PA, a qual por sua vez não foi afetada pela exposição a EVs. Ainda assim, as EVs derivadas de células WT tratadas com PA aumentaram ainda mais os níveis de RIPK3 em células WT tratadas com PA, um efeito que foi anulado pela deficiência em Ripk3. De igual modo, embora os hepatócitos Ripk3-/- tenham uma expressão aumentada de enzimas lipogénicas, estas células apresentaram menor acumulação lipídica, a qual foi ainda mais reduzida pela incubação com Ripk3-/- Hep-EVs. Este efeito foi concomitante com o aumento da expressão de marcadores de β-oxidação e autofagia. Por fim, as células Ripk3-/- apresentam níveis diminuídos de NLRP3 e Tgf-β, indicando que a RIPK3 pode regular a ativação do inflamassoma e a sinalização profibrogénica após sobrecarga lipídica. Em conclusão, a deficiência em Ripk3 protegeu os hepatócitos da lipotoxicidade, acompanhada pela redução da expressão de mediadores pró-inflamatórios e fibrogénicos, bem como alterações no metabolismo lipídico. Além disso, EVs necroptóticos podem ter um papel na comunicação hepatocelular, particularmente afetando o metabolismo lipídico e os níveis de RIPK3 nos hepatócitos vizinhos, provavelmente contribuindo para a patogénese de NAFLD.

2022-11-29Master thesis

Open access

Cytotoxicity of marine fungi extracts on colorectal cancer cells and related mechanisms of action

Publication . Atalaia, Mariana Ramos da Costa; Alves, Celso; Rodrigues, Cecília Maria Pereira

O cancro colorretal (CRC, do inglês colorectal cancer) é o terceiro tipo de cancro com maior incidência sendo responsável por 10% dos diagnósticos e por 9% das mortes associadas. Apesar da existência de uma abordagem terapêutica multidisciplinar intensiva, somente 60% dos pacientes ocidentais consegue atingir a meta dos 5 anos de sobrevivência. A resistência aos regimes terapêuticos é uma ocorrência frequente em quimioterapia podendo ser hereditária ou desenvolvida pelas células cancerígenas por estas após exposição aos fármacos. Estas células também podem desenvolver uma múltipla resistência, a nível estrutural e funcional, a diversos fármacos em simultâneo. Esta problemática é bastante complexa de solucionar devido à heterogeneidade populacional e sub-populacional dos tumores, os quais apresentam diferentes características genéticas e epigenéticas promovendo a agressividade do mesmo. Outras estratégias de resistência consistem na transição epitelial para mesenquimal, desregulação de importantes vias de sinalização, resistência metabólica, mutações adquiridas, evasão da apoptose, ativação de resposta a danos de ADN, assim como readaptações nas células estaminais cancerígenas (CSC, do inglês cancer stem cells). As CSCs são caracterizadas por uma distinta capacidade de autorrenovação, associada à sua tumorigénese. Esta população específica de células faz parte do microambiente tumoral, participando na intercomunicação com as células vizinhas. Estas interações têm como objetivo recrutar e regular os componentes celulares do microambiente tumoral e reestruturar os constituintes da matriz extracelular. Assim, são reunidos os fatores necessários ao desenvolvimento do tumor através do aprimoramento das propriedades intrínsecas das CSCs, como estaminalidade, sobrevivência, capacidade angiogénica, transição epitelial-mesenquimal e metastática. Como tal, o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas, incluindo fármacos com mecanismos de ação distintos é da maior importância. O ambiente marinho, com uma elevada diversidade biológica e química, tem demonstrado ser uma fonte singular de novos metabolitos com características químicas incomuns, distintas e únicas, exibindo novos mecanismos de ação. Os referidos compostos são chamados de metabolitos secundários e estão distribuídos por diferentes classes químicas, tais como alcalóides, terpenóides, esteróides, policetídeos, açúcares, peptídeos, derivados do ácido chiquímico e uma infinidade de outros metabolitos. Estes produtos naturais são comumente produzidos pelos organismos marinhos como resposta a diferentes pressões relacionadas com fatores bióticos e abióticos, como variações de salinidade, pressão e temperatura, exposição à luz ultravioleta, mas também como resposta face à competição pelo espaço, predação, reprodução entre outros. Por este motivo, de entre os organismos marinhos, os vi invertebrados sésseis e os seus microorganismos simbiontes são apontados como importantes alvos de pesquisa farmacológica devido à sua necessidade de readaptação constante a estes fatores. Estudos anteriores sugerem a relação simbiótica entre fungos marinhos e outras espécies de organismos como responsáveis pela produção destes compostos bioativos, pois muitas vezes estes microrganismos são encontrados, como endófitos, em relações simbióticas com, principalmente, invertebrados sésseis. Compostos isolados a partir destes organismos têm sido associados a atividades antibacterianas, antivirais, antifúngicas e anticancerígenas, entre outras. Com a presente dissertação pretendeu-se avaliar o potencial citotóxico de extratos de fungos, isolados do ambiente marinho da costa portuguesa, em diferentes modelos celulares do CRC, mas também tentar compreender os seus mecanismos de ação. Mais especificamente, quatro espécies de fungos isolados do ambiente marinho (Aspergillus pseudoglaucus, Aspergillus chevalieri, Aspergillus fructus e Lindra obtusa) foram cultivadas. De seguida a citotoxicidade dos seus extratos foi avaliada em modelos 2D e num modelo de esferóides de CRC enriquecido em CSCs e, por fim, os efeitos em biomarcadores relacionados com o stress oxidativo, disfunção mitocondrial e apoptose foram avaliados. A biomassa dos fungos foi sujeita a uma extração líquido/ líquido com acetato de etilo obtendose rendimentos entre os 10 e os 82% sendo o mais alto proveniente da espécie Aspergillus chevalieri. Após esta extração, foi realizado um screening em duas linhas celulares de CRC (HCT-15 e Caco-12) e uma linha celular não-tumoral de fibroblastos do cólon (Ccd-18CO) através da avaliação do metabolismo de MTT. O extrato Aspergillus pseudoglaucus foi o mais citotóxico (IC50: 27.93 µg/mL) nas células cancerígenas, enquanto, na linha celular nãotumoral Ccd-18CO, não houve uma sensibilidade significativa à exposição ao extrato nas dosagens testadas. A partir deste screening, a linha celular que se mostrou mais sensível à atividade dos extratos, HCT-15, e o extrato que demonstrou ter uma atividade citotóxica mais marcada, Aspergillus pseudoglaucus, foram selecionados para os ensaios subsequentes. O extracto Aspergillus pseudoglaucus, induziu um aumento da morte celular, na linha HCT15, nos tempos de incubação mais longos (72h, 48h e 24h) sendo que, tais observações, foram corroborados através da diminuição da hidrólise de calceína-AM e do aumento da libertação de LDH. Para além disso, foram avaliados vários marcadores relacionados com a apoptose como o potencial da membrana mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigénio e a atividade da caspase-3. Verificou-se um aumento no potencial da membrana mitocondrial de forma dependente da dose do extrato a partir das 3 horas após a incubação sendo que tal efeito foi- vii se perdendo nos tempos de incubação mais longos, possivelmente refletindo uma resposta adaptativa. A tendência para um aumento na produção de espécies reativas de oxigénio foi evidente após as 6 e as 3 horas de incubação. A tendência para um aumento na atividade de caspase-3 foi clara tanto à concentração de IC50 como à metade do IC50, ao fim de 12 horas de exposição ao extrato. A capacidade citotóxica do extrato Aspergillus pseudoglaucus foi também avaliada na linha celular de CRC HCT116 numa cultura celular 2D de monocamada, através do metabolismo de MTS, e num modelo 3D de tumoresferas enriquecidas em CSCs utilizando o metabolismo de ATP. Comparando os dois modelos celulares, foi observável uma melhor atividade do extrato nos esferoides enriquecidos em CSCs, já que o valor IC50 obtido foi 2.84 µg/mL (95% IC = 2.14 – 3.74), enquanto no modelo tradicional 2D, o valor obtido foi de 43.04 µg/mL (95% IC = 26.91 – 55.89). Os resultados mostraram ainda uma redução na área dos esferoides através da ação do extrato Aspergillus pseudoglaucus. De seguida, de modo a confirmar que o mecanismo de ação do extrato Aspergillus pseudoglaucus tinha por base a via da apoptose, as células HCT116 foram co-incubadas com um inibidor de apoptose, Zvad. Com este inibidor foram realizados ensaios de citotoxicidade e viabilidade celular, mas também de fragmentação nuclear e de ADN, após exposição à concentração de IC50 e a metade do IC50 do extrato. Na presença do inibidor Zvad, foi observada uma tendência para a redução na fragmentação de DNA e na morte celular sendo possível deduzir que a apoptose pode ter um papel importante na morte celular causada pelo extrato. Os objetivos principais desta dissertação de mestrado foram compridos já que o potencial citotóxico das espécies Aspergillus pseudoglaucus, Aspergillus chevalieri, Aspergillus fructus e Lindra obtusa, derivadas do ambiente marinho, foram avaliadas em diferentes linhas celulares de CRC, mas também numa linha celular não tumoral do colon. Para além disso, os dados obtidos sugerem o possível envolvimento da produção de ROS, alterações na MMP e da ativação da Casp3 na citotoxicidade mediada pelo extrato de Aspergillus pseudoglaucus. Foi observada uma possível maior especificidade do extrato no modelo de esferoides de CRC enriquecido em CSCs em relação ao modelo 2D de células HCT116. O envolvimento da apoptose observada também pode ser observado através da co-incubação com inibidor de apoptose Zvad. Estes resultados sugerem que o extrato Aspergillus pseudoglaucus ativa a via de sinalização da apoptose com uma possível maior especificidade para as CSCs. Estes resultados enaltecem o potencial do extrato Aspergillus pseudoglaucus como fonte de compostos citotóxicos para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para o tratamento do CRC.

2023-12-19Master thesis

Embargoed access