Cytotoxicity of marine fungi extracts on colorectal cancer cells and related mechanisms of action

Atalaia, Mariana Ramos da Costa

http://hdl.handle.net/10451/63098

Use this identifier to reference this record.

Name:	Description:	Size:	Format:
TM_Mariana_Atalaia.pdf		1.57 MB	Adobe PDF	Download

Send Feedback

Authors

Atalaia, Mariana Ramos da Costa

Advisor(s)

Alves, Celso

Rodrigues, Cecília Maria Pereira

Abstract(s)

O cancro colorretal (CRC, do inglês colorectal cancer) é o terceiro tipo de cancro com maior incidência sendo responsável por 10% dos diagnósticos e por 9% das mortes associadas. Apesar da existência de uma abordagem terapêutica multidisciplinar intensiva, somente 60% dos pacientes ocidentais consegue atingir a meta dos 5 anos de sobrevivência. A resistência aos regimes terapêuticos é uma ocorrência frequente em quimioterapia podendo ser hereditária ou desenvolvida pelas células cancerígenas por estas após exposição aos fármacos. Estas células também podem desenvolver uma múltipla resistência, a nível estrutural e funcional, a diversos fármacos em simultâneo. Esta problemática é bastante complexa de solucionar devido à heterogeneidade populacional e sub-populacional dos tumores, os quais apresentam diferentes características genéticas e epigenéticas promovendo a agressividade do mesmo. Outras estratégias de resistência consistem na transição epitelial para mesenquimal, desregulação de importantes vias de sinalização, resistência metabólica, mutações adquiridas, evasão da apoptose, ativação de resposta a danos de ADN, assim como readaptações nas células estaminais cancerígenas (CSC, do inglês cancer stem cells). As CSCs são caracterizadas por uma distinta capacidade de autorrenovação, associada à sua tumorigénese. Esta população específica de células faz parte do microambiente tumoral, participando na intercomunicação com as células vizinhas. Estas interações têm como objetivo recrutar e regular os componentes celulares do microambiente tumoral e reestruturar os constituintes da matriz extracelular. Assim, são reunidos os fatores necessários ao desenvolvimento do tumor através do aprimoramento das propriedades intrínsecas das CSCs, como estaminalidade, sobrevivência, capacidade angiogénica, transição epitelial-mesenquimal e metastática. Como tal, o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas, incluindo fármacos com mecanismos de ação distintos é da maior importância. O ambiente marinho, com uma elevada diversidade biológica e química, tem demonstrado ser uma fonte singular de novos metabolitos com características químicas incomuns, distintas e únicas, exibindo novos mecanismos de ação. Os referidos compostos são chamados de metabolitos secundários e estão distribuídos por diferentes classes químicas, tais como alcalóides, terpenóides, esteróides, policetídeos, açúcares, peptídeos, derivados do ácido chiquímico e uma infinidade de outros metabolitos. Estes produtos naturais são comumente produzidos pelos organismos marinhos como resposta a diferentes pressões relacionadas com fatores bióticos e abióticos, como variações de salinidade, pressão e temperatura, exposição à luz ultravioleta, mas também como resposta face à competição pelo espaço, predação, reprodução entre outros. Por este motivo, de entre os organismos marinhos, os vi invertebrados sésseis e os seus microorganismos simbiontes são apontados como importantes alvos de pesquisa farmacológica devido à sua necessidade de readaptação constante a estes fatores. Estudos anteriores sugerem a relação simbiótica entre fungos marinhos e outras espécies de organismos como responsáveis pela produção destes compostos bioativos, pois muitas vezes estes microrganismos são encontrados, como endófitos, em relações simbióticas com, principalmente, invertebrados sésseis. Compostos isolados a partir destes organismos têm sido associados a atividades antibacterianas, antivirais, antifúngicas e anticancerígenas, entre outras. Com a presente dissertação pretendeu-se avaliar o potencial citotóxico de extratos de fungos, isolados do ambiente marinho da costa portuguesa, em diferentes modelos celulares do CRC, mas também tentar compreender os seus mecanismos de ação. Mais especificamente, quatro espécies de fungos isolados do ambiente marinho (Aspergillus pseudoglaucus, Aspergillus chevalieri, Aspergillus fructus e Lindra obtusa) foram cultivadas. De seguida a citotoxicidade dos seus extratos foi avaliada em modelos 2D e num modelo de esferóides de CRC enriquecido em CSCs e, por fim, os efeitos em biomarcadores relacionados com o stress oxidativo, disfunção mitocondrial e apoptose foram avaliados. A biomassa dos fungos foi sujeita a uma extração líquido/ líquido com acetato de etilo obtendose rendimentos entre os 10 e os 82% sendo o mais alto proveniente da espécie Aspergillus chevalieri. Após esta extração, foi realizado um screening em duas linhas celulares de CRC (HCT-15 e Caco-12) e uma linha celular não-tumoral de fibroblastos do cólon (Ccd-18CO) através da avaliação do metabolismo de MTT. O extrato Aspergillus pseudoglaucus foi o mais citotóxico (IC50: 27.93 µg/mL) nas células cancerígenas, enquanto, na linha celular nãotumoral Ccd-18CO, não houve uma sensibilidade significativa à exposição ao extrato nas dosagens testadas. A partir deste screening, a linha celular que se mostrou mais sensível à atividade dos extratos, HCT-15, e o extrato que demonstrou ter uma atividade citotóxica mais marcada, Aspergillus pseudoglaucus, foram selecionados para os ensaios subsequentes. O extracto Aspergillus pseudoglaucus, induziu um aumento da morte celular, na linha HCT15, nos tempos de incubação mais longos (72h, 48h e 24h) sendo que, tais observações, foram corroborados através da diminuição da hidrólise de calceína-AM e do aumento da libertação de LDH. Para além disso, foram avaliados vários marcadores relacionados com a apoptose como o potencial da membrana mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigénio e a atividade da caspase-3. Verificou-se um aumento no potencial da membrana mitocondrial de forma dependente da dose do extrato a partir das 3 horas após a incubação sendo que tal efeito foi- vii se perdendo nos tempos de incubação mais longos, possivelmente refletindo uma resposta adaptativa. A tendência para um aumento na produção de espécies reativas de oxigénio foi evidente após as 6 e as 3 horas de incubação. A tendência para um aumento na atividade de caspase-3 foi clara tanto à concentração de IC50 como à metade do IC50, ao fim de 12 horas de exposição ao extrato. A capacidade citotóxica do extrato Aspergillus pseudoglaucus foi também avaliada na linha celular de CRC HCT116 numa cultura celular 2D de monocamada, através do metabolismo de MTS, e num modelo 3D de tumoresferas enriquecidas em CSCs utilizando o metabolismo de ATP. Comparando os dois modelos celulares, foi observável uma melhor atividade do extrato nos esferoides enriquecidos em CSCs, já que o valor IC50 obtido foi 2.84 µg/mL (95% IC = 2.14 – 3.74), enquanto no modelo tradicional 2D, o valor obtido foi de 43.04 µg/mL (95% IC = 26.91 – 55.89). Os resultados mostraram ainda uma redução na área dos esferoides através da ação do extrato Aspergillus pseudoglaucus. De seguida, de modo a confirmar que o mecanismo de ação do extrato Aspergillus pseudoglaucus tinha por base a via da apoptose, as células HCT116 foram co-incubadas com um inibidor de apoptose, Zvad. Com este inibidor foram realizados ensaios de citotoxicidade e viabilidade celular, mas também de fragmentação nuclear e de ADN, após exposição à concentração de IC50 e a metade do IC50 do extrato. Na presença do inibidor Zvad, foi observada uma tendência para a redução na fragmentação de DNA e na morte celular sendo possível deduzir que a apoptose pode ter um papel importante na morte celular causada pelo extrato. Os objetivos principais desta dissertação de mestrado foram compridos já que o potencial citotóxico das espécies Aspergillus pseudoglaucus, Aspergillus chevalieri, Aspergillus fructus e Lindra obtusa, derivadas do ambiente marinho, foram avaliadas em diferentes linhas celulares de CRC, mas também numa linha celular não tumoral do colon. Para além disso, os dados obtidos sugerem o possível envolvimento da produção de ROS, alterações na MMP e da ativação da Casp3 na citotoxicidade mediada pelo extrato de Aspergillus pseudoglaucus. Foi observada uma possível maior especificidade do extrato no modelo de esferoides de CRC enriquecido em CSCs em relação ao modelo 2D de células HCT116. O envolvimento da apoptose observada também pode ser observado através da co-incubação com inibidor de apoptose Zvad. Estes resultados sugerem que o extrato Aspergillus pseudoglaucus ativa a via de sinalização da apoptose com uma possível maior especificidade para as CSCs. Estes resultados enaltecem o potencial do extrato Aspergillus pseudoglaucus como fonte de compostos citotóxicos para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para o tratamento do CRC.

Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer accounting for 9% of the related deaths. Resistance to treatment is a common challenge in chemotherapy, since tumours present a heterogeneous cellular population granting them different levels of resistance. Therefore, the discovery of new anticancer drugs is of utmost relevance. Around 71% of the Earth' surface is occupated by water, in which oceans exhibts a huge chemical and biological diversity. Previous studies reported the relevance of symbiotic relationship between microorganisms, as fungi, and macroorganisms in the biosynthesis of compounds with great biological activities, including antibacterial, antiviral, antifungal and anticancer. This dissertation aimed to evaluate the cytotoxicity of fungal extracts, isolated from the marine environment, in 2D and 3D cellular models of colorectal cancer, and also to comprehend their mechanisms of action underlying the activities observed. The fungi extraction was performed using ethyl acetate as solvent. The highest yield extractions was obtained with Aspergillus chevalieri, reaching 82%. A cytotoxicity screening was performed using Caco-2 and HCT-15 CRC cells and a nontumourigenic colon cell line (Ccd-18Co). The extracts exhibited selectivity for HCT-15 cells, being the highest cytotoxic effect mediated by Aspergillus pseudoglaucus extract (IC50: 27.93 µg/mL), which was selected for a time-course study using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl-2H-tetrazolium bromide metabolism, lactate dehydrogenase release and calcein-AM hydrolysis assays. Increased cell death was observed at longer incubation times. In addition distinct hallmarks related with oxidative stress, mithocondrial disfuction and apoptosis were studied. The effects mediated by Aspergillus pseudoglaucus extract led to the production of ROS, loss of mitochodrial membrane permeability, and caspase-3 activation. In addition, the cytotoxicity of Aspergillus pseudoglaucus extract was also evaluated in an 2D monolayer and 3D cancer stem cell (CSC)-eriched tumourpheres of HCT116 cell models. The results showed a greater specificity of the extract in the HCT116 CSCs-enriched spheroid model (IC50 of 2D cellular model: 43.04 µg/mL; IC50 of spheroids: 2.84 µg/mL). Moreover, preliminary data showed that Aspergillus pseudoglaucus induced a reduction in the area of the CSCs-enriched HCT116 tumourspheres. The involvement of apoptosis on Aspergillus pseudoglaucus extract cytotoxicity was also re-inforced by the treatment of HCT116 cells with fungi extract in the presence of Z-Val-ala-asp-fluoromethylketon pan-capase (Zvad) apoptosis inhibitor, which promoted an increase of cell viability and a decrease of apoptotic nuclei. All together the results here reported suggest Aspergillus pseudoglaucus extract as a promissing source of cytotoxic compounds to inspire the development of new anticancer medicines for CRC treatment.