PRECISION ONCOLOGY BY INNOVATIVE THERAPIES AND TECHNOLOGIES

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Palladium-catalyzed allylic substitution between C-based nucleophiles and 6-azabicyclo[3.1.0]-hex-3-en-2-oxy derivatives: A new selectivity paradigm

Publication . Oliveira, João; Kiala, Gredy; Siopa, Filipa; Bernard, Aurélie; Gontard, Geoffrey; Oble, Julie; Afonso, Carlos; Poli, Giovanni

The reaction between α-hydroxy-(or α-acetoxy) cyclopenten-aziridines (6-azabicyclo[3.1.0]hex-3-en-2-ols or acetates) and C-based nucleophiles in the presence of Pd(0)-catalysis was investigated. In all the cases studied, the reaction was totally regio- and diastereo-selective, affording a single adduct in moderate to good yields. Specifically, attack of the nucleophile at position 3 of the cyclopentene moiety, anti to the vicinal oxy group, with vinylogous ring opening of the aziridine ring, was observed. When the carbon acid is a very acidic methylene (pKa (DMSO) ≤ 7.3), the resulting adduct is a zwitterion, resulting from an intramolecular proton transfer between the amino group and the carbon acid moiety taking place after the C–C bond formation. A plausible mechanism for this transformation is put forward.

2020-04Journal article

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A high-throughput screening system to identify modulators of cancer stem cells and improve chemotherapy sensitization

Publication . Carreira, Ágata Sofia Assunção; Solá, Susana; Rodrigues, Cecilia M. P.

Over the last decades, cancer has become a major public health concern worldwide with an estimate of approximately 18 million new cancer cases and 9.6 million deaths from cancer in 2018. In fact, cancer is expected to be the leading cause of death in every country in the 21st century. The overall ageing of the world population is a key risk factor, although several other factors including the economic development and associated life style play an important role in disease incidence. Cancer stem cells (CSCs) are a subset of cancer cells within the tumour niche. They are characterized not only by long-lasting properties but also by the ability to resist to conventional anti-cancer therapies. In fact, conventional anti-cancer therapies that affect the tumor bulk, apart from their generalized cytotoxic activity, are ineffective in CSCs in the long-term. Therefore, the identification of CSCs as tumour initiating cells offers the possibility of CSC targeted therapies, which may lead to tumour differentiation and eventually its complete eradication. This project aimed to optimize and validate a novel screening platform that allows the identification of compounds that target CSCs, by inducing either CSC differentiation or elimination. We were able to establish a high-throughput screening (HTS) system to find molecules that selectively target CSCs through the use of human colon cancer HT-29-derived tumourspheres in 96-well plates subjected to metabolism-based viability assays. By using this particular screening platform, we pursued our studies by further investigating hit compound 307 as an anti-CSC agent that impacts on tumoursphere formation, and significantly reduces tumoursphere size and stemness-associated gene expression. Moreover, analysis of protein steady-state and mRNA levels indicate that 307 also increases the differentiation process. Finally, given the relevance of CSCs in tumour recurrence, the potential of combined therapy of 307 and conventional chemotherapeutics was also investigated. Interestingly, 307 did not enhance chemotherapeutic sensitivity but, in combination with FOLFIRI, decreased the size of tumourspheres in a synergistic manner, suggesting a potential role in repressing tumour self-renewal. Altogether, these results not only offer a novel HTS platform to test a wide range of candidate compounds to target CSCs, but also allowed the identification of a hit molecule. Future work should further characterise precise molecular mechanism of action and prioritise hit-to-lead development studies in medicinal chemistry.

2018-12-19Master thesis

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Evaluation of Tissue and Circulating miR-21 as Potential Biomarker of Response to Chemoradiotherapy in Rectal Cancer

Publication . Ourô, Susana; Mourato, Cláudia; Ferreira, Marisa P.; Albergaria, Diogo; Cardador, André; Castro, Rui E.; Maio, Rui; Rodrigues, Cecília M. P.

Response to chemoradiotherapy (CRT) in patients with locally advanced rectal cancer (RC) is quite variable and it is urgent to find predictive biomarkers of response. We investigated miR-21 as tissue and plasma biomarker of response to CRT in a prospective cohort of RC patients; The expression of miR-21 was analyzed in pre- and post-CRT rectal tissue and plasma in 37 patients with RC. Two groups were defined: Pathological responders (TRG 0, 1 and 2) and non-responders (TRG 3). The association between miR-21, clinical and oncological outcomes was assessed; miR-21 was upregulated in tumor tissue and we found increased odds of overexpression in pre-CRT tumor tissue (OR: 1.63; 95% CI: 0.40–6.63, p = 0.498) and pre-CRT plasma (OR: 1.79; 95% CI: 0.45–7.19, p = 0.414) of non-responders. The overall recurrence risk increased with miR-21 overexpression in pre-CRT tumor tissue (HR: 2.175, p = 0.37); Significantly higher miR-21 expression is observed in tumor tissue comparing with non-neoplastic. Increased odds of non-response is reported in patients expressing higher miR-21, although without statistical significance. This is one of the first studies on circulating miR-21 as a potential biomarker of response to CRT in RC patients.

2020-09-14Journal article

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The mechanism of action of pepR, a viral-derived peptide, against Staphylococcus aureus biofilms

Publication . Pinto, Sandra; Dias, Susana; Cruz, Ana F; Mil-Homens, Dalila; Fernandes, Fabio; Valle, Javier; Andreu, David; Prieto, Manuel; Castanho, Miguel A. R. B.; Coutinho, Ana; Veiga, Ana Salomé

Objectives: To investigate the mechanism of action at the molecular level of pepR, a multifunctional peptide derived from the Dengue virus capsid protein, against Staphylococcus aureus biofilms. Methods: Biofilm mass, metabolic activity and viability were quantified using conventional microbiology techniques, while fluorescence imaging methods, including a real-time calcein release assay, were employed to investigate the kinetics of pepR activity at different biofilm depths. Results: Using flow cytometry-based assays, we showed that pepR is able to prevent staphylococcal biofilm formation due to a fast killing of planktonic bacteria, which in turn resulted from a peptide-induced increase in the permeability of the bacterial membranes. The activity of pepR against pre-formed biofilms was evaluated through the application of a quantitative live/dead confocal laser scanning microscopy (CLSM) assay. The results show that the bactericidal activity of pepR on pre-formed biofilms is dose and depth dependent. A CLSM-based assay of calcein release from biofilm-embedded bacteria was further developed to indirectly assess the diffusion and membrane permeabilization properties of pepR throughout the biofilm. A slower diffusion and delayed activity of the peptide at deeper layers of the biofilm were quantified. Conclusions: Overall, our results show that the activity of pepR on pre-formed biofilms is controlled by its diffusion along the biofilm layers, an effect that can be counteracted by an additional administration of peptide. Our study sheds new light on the antibiofilm mechanism of action of antimicrobial peptides, particularly the importance of their diffusion properties through the biofilm matrix on their activity.

2019Journal article

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Small molecules for cancer immunotherapy: a melanoma approach

Publication . Serronha, Lara Inês Silva; Ferreira, Helena Isabel Fialho Florindo Roque; Guedes, Rita Alexandra do Nascimento Cardos

O cancro constitui um dos principais e maiores problemas de saúde, a nível mundial, e continua a ser urgente o desenvolvimento de abordagens terapêuticas mais seguras, mas também eficazes que permitam controlar os estados mais avançados desta doença. Apesar dos progressos feitos nos últimos anos, na prevenção, diagnóstico e tratamento, a sua incidência continua a aumentar, sendo uma das principais causas de mortalidade. De facto, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) estima-se que em 2030 se registem mais de 13 milhões de vítimas mortais. Em termos gerais, o cancro engloba um vasto conjunto de doenças caracterizado por uma proliferação celular anormal e descontrolada. No caso de ser um tumor maligno, este pode desenvolver a capacidade de invadir e danificar os tecidos e órgãos adjacentes, por via linfática, num processo denominado por metastização. De todos os cancros humanos, o cancro da pele é um dos mais frequentes, e apesar de constituir uma pequena fração das neoplasias cutâneas, o melanoma representa o tipo de cancro da pele mais agressivo e mortal. O melanoma maligno é um tumor consideravelmente heterogéneo que resulta da ação combinada de diversos fatores, incluindo genéticos, individuais, ambientais, entre outros, estando o seu prognóstico fortemente relacionado com o estado da doença quando diagnosticada. Para além da excisão cirúrgica, quando diagnosticado precocemente, outras opções terapêuticas incluem a quimioterapia (com os agentes Dacarbazina e Temozolomida) e radioterapia, no entanto nenhuma delas tem um potencial igualmente curativo e os resultados clínicos são limitados. O melanoma avançado, e na sua forma metastática, é altamente caraterizado pela resistência à maioria das terapias convencionais e a sua mortalidade aumenta por falta de outras opções eficazes de tratamento. Assim, as terapias têm vindo a evoluir a partir de estratégias relativamente inespecíficas, para abordagens mais direcionadas. A partir de 2011 doentes afetados pela forma disseminada desta doença passaram a poder usufruir de novos agentes terapêuticos direcionados para alvos específicos identificados como estando associados aos estados mais agressivos desta doença. Destacam-se a aprovação de inibidores de BRAF/MEK, e mais tarde, de moduladores de vias de sinalização associadas a immune checkpoints. A imunoterapia, em oncologia, tem como objetivo restaurar ou amplificar uma resposta imune anti-tumoral por parte do hospedeiro, através da activação de uma rede complexa de células, que inclui linfócitos CD8+ efectores e CD4+ auxiliares, linfócitos B, células natural killer (NK), células dendríticas (DC), entre outras, bem como a libertação de citocinas e mediadores inflamatórios por parte destas células efectoras. No entanto, o tumor tem a capacidade de utilizar mecanismos de supressão fisiológicos, para 9 escapar a uma resposta imunitária, e criar um microambiente tumoral que favorece a sua proliferação e crescimento. Entre outros, o aumento da expressão de moléculas de regulação da resposta imune, que inclui os recetores proteína 4 associada aos linfócitos T citotóxicos, CTLA- 4, e morte celular-programada 1, PD-1, como mecanismo de inibição da ativação dos linfócitos T, estão entre os mecanismos mais utilizados para bloquear a acitividade anti-tumoral do sistema imunitário. Desta forma, o desenvolvimento de terapias que inibam estas moléculas, conhecidas como “immune checkpoints”, afigura-se como promissor no combate a um crescente número de tumores. Mais especificamente, a aprovação de anticorpos monoclonais anti- PD-1/PD-L1, como o Pembrolizumab e Nivolumab, tem vindo a revolucionar as opções de tratamento para doentes com melanoma, tendo já demonstrado benefícios clínicos e aumento de respostas objetivas, quando comparados à quimioterapia tradicional. No entanto, o aparecimento de mecanismos de resistência primária ou adquirida, e a indução de efeitos adversos são alguns dos fatores que ainda limitam a sua utilização. Além disso, ainda que a combinação destes modeladores com outras abordagens terapêuticas tenha permitido melhorar alguns destes aspetos, apenas uma percentagem de doentes responde a estas terapêuticas combinadas, observando-se o desenvolvimento de resistências. Desta forma, torna-se urgente o desenvolvimento de alterativas imunoterapêuticas que permitam sensibilizar o microambiente tumoral de forma a que volte a ser susceptível à ação anti-tumoral destas abordagens atualmente tão clinicamente relevantes. Recentemente, a utilização de pequenas moléculas como inibidores de immune checkpoints tem vindo a receber maior atenção devido às vantagens que apresentam sobre os convencionais anticorpos monoclonais, nomeadamente: capacidade de atravessar várias barreiras fisiológicas e biológicas; maior permeabilidade celular e difusão no microambiente tumoral, especialmente no caso de tumores sólidos; melhoria no perfil farmacocinético e farmacodinâmico; diminuição dos efeitos adversos; menor custo de produção e possibilidade para administração oral, entre outras. Para além disto, o avanço na nanotecnologia e no desenvolvimento de nanoestruturas para “drug delivery” tem vindo a possibilitar a síntese de nanomateriais com diferentes características, dependendo da ação terapêutica pretendida, bem como das propriedades fisico-químicas das moléculas ativas que por eles serão transportadas. Assim, a incorporação destas pequenas moléculas imunomoduladoras, assim como antigénios tumorais e potenciadores de resposta imune, em nanopartículas (NP) biocompatíveis e biodegradáveis irá, não só, permitir uma entrega eficaz, segura, e não-tóxica, mas também, aumentar a sua acumulação específica no local de interesse. Para além disso, irá também permitir uma libertação controlada do composto10 melhorando ainda mais a já promissora abordagem da inibição de immune checkpoints com pequenas moléculas com actividade biológica. Para além disso, a capacidade de modificação das propriedades biofísicas (ex: tamanho, carga e morfologia) das NP permite obter nanoplataformas de entrega desenhadas tendo em vista a sua interação com os sistemas biológicos alvo, aumentando a eficácia desta abordagem terapêutica. Assim, o principal objectivo do trabalho aqui descrito foi desenvolver NP poliméricas de ácido poliláctico (PLA) capazes de incorporar uma pequena molécula anti-Ligando-1 do Recetor da Morte Celular Programada, PD-L1 e a avaliação do seu efeito em células imunes e tumorais. Para tal, o efeito da pequena molécula #56 anti PD-L1 livre ou incorporada nas NP na viabilidade celular foi avaliado em duas linhas celulares (células dendríticas JAWSII (ATCC® CRL-11904™), melanoma, B16F10 (ATCC® CRL-6475™)), que representam subpopulações que expressam níveis mais elevados de PD-L1 no microambiente tumoral altamente imunosupressor. Avaliou-se de igual forma o efeito desta pequena molécula, livre ou incorporada nas NP, na inibição do PD-L1 na linha celular de melanoma anteriormente referida. Sendo que a indução de uma resposta imunológica robusta com a estimulação de linfócitos T CD4+ e CD8+, depende também da apresentação eficaz de antigénios tumorais pelas DC, actualmente reconhecidas como entidades fundamentais na estimulação de uma resposta imune eficaz, foi preparada e caracterizada uma NP multivalente, tendo em vista o transporte de combinações da pequena molécula anti PD-L1, com péptidos antigénicos de melanoma (Melan-A/MART-1) e o imuno potenciador CpG, de forma a que o expectável efeito sinérgico resulte numa maior eficácia anti-tumoral. Os resultados aqui descritos demonstram que as NP desenvolvidas, utilizando os métodos de única ou dupla emulsão com evaporação de solvente, apresentaram as características ideais para os objectivos anteriormente descritos, com um diâmetro hidrodinâmico médio inferior a 200 nm, uma distribuição de tamanhos homogénea (PdI < 0.2) com carga superficial negativa inferior a -8 mV. Importa realçar também a estabilidade e reprodutibilidade das NP preparadas por ambos os métodos, em particular o de dupla emulsão, sendo os valores de desvio padrão, para qualquer uma das características físico químicas, mínimo. Para além disto, estas NP permitiram eficiências de encapsulação, EE (% (w/w), e capacidade de carga, LC (μg/mg), elevadas para qualquer uma das biomoléculas activas incorporadas. Foi possível confirmar, com o ensaio de toxicidade, que até à concentração 10 μM, tanto as células dendríticas como as tumorais, toleraram a biomolécula activa anti-PD-L1 na sua forma livre e quando incorporada em NP de PLA, o que confirmou a sua potencial utilização no tratamento de melanoma. Para concentrações mais elevadas, a incorporação da biomolécula activa 11 anti-PD-L1 foi claramente vantajosa, por ter um menor efeito na viabilidade celular. Para além disto, o facto de apresentarem maior toxicidade nas células tumorais pode constituir uma vantagem apesar do mecanismo associado não ter sido identificado. Apesar do potencial inibitório desta molécula anti-PD-L1 ser inferior ao do anticorpo monoclonal testado, esta abordagem terapêutica tem claras vantagens para a sua potencial aplicação in vivo, nomeadamente a nível da redução de efeitos secundários adversos, daí que tenha que ser feito um compromisso entre eficácia e segurança. Considerando o trabalho aqui reportado, é possível concluir que a optimização de NP poliméricas para o transporte de uma pequena molécula moduladora do checkpoint imunológico PD-L1, permitiu desenvolver uma abordagem terapêutica promissora para o tratamento do melanoma, que futuramente, poderá ser usada como alternativa aos anticorpos monoclonais. Em particular, a incorporação de misturas da biomolécula activa anti-PD-L1, com antigénios tumorais e imunopotenciadores em NP poliméricas, representa uma abordagem promissora para potenciar uma resposta imunitária anti-tumoral mais robusta e eficaz, com indução de memória. Assim, a entrega simultânea de TAA e imunoadjuvantes da resposta imunitária diretamente às células apresentadoras de antigénios, as DC, com moléculas bioactivas contra mecanismos de supressão da resposta imune, poderá representar uma estratégia terapêutica inovadora, não só para o melanoma, mas para o cancro no geral.

2021-02-26Master thesis

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