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Publicação
Validation of an automated equipment for depression induction in a rodent model
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Orientador(es)
Resumo(s)
Depression is a multidimensional psychiatric disorder that affects around 350 million people worldwide. In order to study new treatment approaches for this disease it is of major importance to use animal models. However, the generation of valid and effective animal models of depression has been a challenging task for many researchers that work in this field.
The mostly used models are based on the following validation criteria: face, construct and predictive, validated by Willner. Face validity is whether the model mimics the core symptoms of the disease, construct validity takes into account the theoretical rational behind the features observed and predictive validity evaluates its correlation with treatment efficiency in the clinics.
There are several animal models of depression, some are based on stress exposure, others on (bio)chemical manipulations, others are models based on genetics or even derived from lesions. For pre-clinical studies the models based on stress exposure are the most reliable because they allow to evaluate the effects of a drug on an organism, as an integrated system. Furthermore, the Unpredictable chronic mild stress (uCMS) is a widely used model, based on stress, mainly due to its etiological similarity with the human disease and also for the fulfilment of all the validation criteria mentioned before. The main weakness of this model is its reduced reproducibility between laboratories, most likely to derive from the lack of standardization. Additionally, this model is very time-consuming, demanding from the operational point of view and susceptible to variability in protocol execution.
In order to overcome these issues, the company where I performed this master thesis, Bn’ML – Behavior and Molecular Lab, developed an equipment capable of performing the uCMS protocol in a standardized and automated manner. This company is a start-up from the University of Minho that works in the evaluation of behavioural and molecular effects of therapeutic compounds, in animal models of psychiatric diseases.
This work was developed at the ICVS/3B’s laboratory, where B’nML is incubated and had two main goals: the first was the accompaniment and supervision of the prototype construction as well as to test and improve the adapted stressors, individually; the second was to validate this protocol adaptation in a pilot study with a small cohort of animals.
Within the scope of the first objective, we completed the prototype construction (similar to a rack) and connected this equipment to a computer, which allowed the robotization of a process that was fully executed by the experimenter. Then, we reformulated some of the actual stressors that are part of the uCMS protocol, for that we divided them into three main categories: total automated stressors, partial automated stressors and non-automated ones.
Total automated stressors were introduced in the equipment functions – these stressors are performed without any manipulation of the experimenter. Partial stressors are not controlled by the rack but their way of being implemented was modified in order to adapt to a more user-friendly structure. Finally, non-automated stressors refers to the ones that remained unchanged and so their execution was exactly the same as in the original protocol. After proving that these adapted stressors could lead to a similar stress response when compared to the original stressors (through their individual test with animals), these adapted ones were integrated into the equipment to allow the performance of a complete protocol, in a pilot study format.
For the second objective, we integrate all the adaptations to the original procotol (uCMS) in a pilot-study, which enable us to reach useful and original outcomes with regard to technical and methodological approaches. The main outcomes obtained were a space-demanding reduction, saving time, a decrease in labour-intensity work, a more uniform exposure of the cages to the protocol (less variability) as well as a reduction of experimenter manipulation of the animals. These alterations may contribute to overcome some known limitations of the uCMS protocol.
The results from the pilot study were evaluated to understand if the proposed validation criteria were fulfilled. For that, a group of animals was exposed to the automated protocol (auCMS) and compared to a group exposed to the manual protocol (uCMS) and to the control group (CT). Some of the animals from the auCMS group were treated with an antidepressant, fluoxetine, to verify its ability to revert the induced phenotype. The validation criteria were assessed through molecular and cellular insights (construct validity), behavioural tests (face validity) and treatment efficacy (predictive validity). Molecular findings from corticosterone levels showed a disruption of the circadian regulation of animals exposed to auCMS, like it was observed with the uCMS group. Regarding neuronal morphology in the hippocampal dentate gyrus (DG), both stressed groups (uCMS and auCMS) showed unclear results in dendritic length and in complexity of dorsal DG neurons. Despite the validation of the molecular component, construct validity can only be partially validated due to the lack of robust results from cellular findings.
Face validity was evaluated through behavioural tests for the 3 dimensions (cognition, anxiety and humor), known to be affected in this disease. Results from cognition and anxiety show significant differences between control group and auCMS group, with a worse performance of this last group. Mood dimension was assessed through 3 different tests: SPT and SDT (anehonic tests), in which we only observed statistical differences between the CT and uCMS groups; and the FST (learn-helplessness test) that showed statistical differences between the CT and auCMS groups. These unclear results can be related to methodological difficulties of this type of tests.
Despite this inconsistence it is possible to claim a validation of this criteria since all the behavioural tests showed a worse performance in the auCMS group when compared to CT ones, and in those where there is not a statistical significance it exists a tendency in that way.
Lastly, some animals from the auCMS group were treated with fluoxetine and allowed to perform the same behavioural tests. Although not all animals reached statistical differences, results showed an improvement of the treated group in all the tests, which may be considered a fulfilment of the predictive validity.
Apart from these criteria, Belzung introduced another concept that intends to validate the strains used. Our study also took this parameter into account since our choice relapsed on Wistar Han – a strain that is consensually accepted to study depression.
Overall the validation criteria evaluated showed promising results since the majority of them indicate a similar response to the manual protocol and divergent from the control ones.
Importantly, this pilot study produced preliminary results based on a small number of animals raising the need to repeat the experiments in order to confirm the results observed. Another limitation is related to the nature of a pilot study itself, as it was the first study developed with the equipment and some improvement needs were identified. As it was expected, some failures of the equipment occurred as well as errors in the programmed protocol; these issues were promptly resolved, however, these problems may have influenced the animals stress induction and could have been a cause for some alterations in the phenotype acquisition.
Although this work has been developed to study depression through a protocol of chronic stress exposure, the stated equipment can be used for other diseases since it is capable of performing other types of protocols. We believe that this innovation will allow developing more robust and reliable animal models. In fact, viable animal models are crucial to health sciences research, particularly to the improvement of the actual pre-clinical approaches. I consider that an important step toward progress in the field of preclinical research has been made.
A depressão é uma doença psiquiátrica multidimensional que afeta cerca de 350 milhões de pessoas em todo o mundo. O uso de modelos animais é muito importante no contexto da investigação e desenvolvimento de novos medicamentos para tratar a depressão, na fase de ensaios pré-clínicos. No entanto, a criação de modelos animais de depressão válidos e eficazes tem sido um desafio para vários investigadores deste campo. Os modelos mais usados são baseados nos seguintes critérios de validação: semelhança (face validity), homologia (construct validity) e predição (predictive validity), validados por Willner. O critério de semelhança diz respeito à capacidade do modelo de mimetizar os principais sintomas da doença. O critério de homologia tem em consideração a fundamentação teórica por detrás das características observadas e o critério de predição avalia a correlação com a eficácia do tratamento na clínica. Há vários modelos animais de depressão, uns são baseados na exposição ao stress, outros em manipulações (bio)químicas, outros baseados em genética e há mesmo alguns derivados de lesões. Para estudos pré-clínicos os modelos baseados na exposição ao stress são os mais fidedignos porque permitem uma avaliação do fármaco num organismo, enquanto sistema integrado. Para além disso, o stress crónico moderado e imprevisível (uCMS) é um modelo amplamente utilizado pela sua similaridade etiológica com a doença humana e pelo preenchimento de todos os critérios de validação referidos. A principal fraqueza do modelo é a sua pouca reprodutibilidade entre laboratórios, muito provavelmente derivada da falta de padronização. Adicionalmente, trata-se de um modelo moroso, exigente do ponto de vista operacional e suscetível a variabilidade na execução do protocolo. Para ultrapassar estes problemas, a empresa onde desenvolvi esta tese de mestrado, Bn’ML – Behavior and Molecular Lab, desenvolveu um equipamento capaz de executar o protocolo de uCMS de uma forma padronizada e automatizada. Esta empresa é uma start-up da Universidade do Minho que trabalha na avaliação de efeitos comportamentais e moleculares de compostos terapêuticos, em modelos animais de doenças psiquiátricas. Este trabalho, desenvolvido no laboratório ICVS/3B’s - onde está incubada a Bn’ML, teve 2 objetivos principais: o primeiro foi o acompanhamento e supervisão da construção do protótipo assim como o teste e melhoramento individual dos stressores adaptados; o segundo foi a validação do protocolo de uCMS adaptado num estudo piloto utilizando um pequeno número de animais. No âmbito do primeiro objetivo concluímos a construção do protótipo (semelhante a uma rack) e conectámos este equipamento a um computador, o que permitiu a robotização de um processo que era integralmente executado pelo operador. De seguida reformulámos alguns dos stressores que fazem parte do protocolo de uCMS, para isso dividimo-los em três categorias principais: stressores totalmente automáticos, stressores parcialmente automáticos e stressores não automáticos. Os stressores totalmente automáticos foram introduzidos nas funções do equipamento - estes stressores são executados sem qualquer manipulação por parte do operador. Stressores parcialmente automáticos não são controlados pela rack mas a sua forma de implementação foi modificada de forma a ser adaptada a uma estrutura de mais fácil uso para o operador. Finalmente, stressores não automáticos refere-se aos que permaneceram iguais e portanto a sua execução foi exatamente igual à do protocolo original. Após provar que estes stressores adaptados desenvolviam a uma resposta ao stress similar aquela que ocorre em stressores originais (através do seu teste individual com animais), estes stressores foram integrados no equipamento para possibilitar o desenvolvimento de um protocolo completo, no formato de um estudo piloto. Para o segundo objetivo, integrámos todas as adaptações ao protocolo original (uCMS) num estudo piloto, o que nos possibilitou atingir resultados úteis e originais no que diz respeito às abordagens técnicas e metodológicas. Os principais resultados obtidos foram a redução do espaço necessário para executar este protocolo, a poupança de tempo, a diminuição da intensidade de trabalho, uma exposição mais uniforme das caixas dos animais ao protocolo (menos variabilidade), assim como a redução da manipulação dos animais. Estas alterações podem contribuir para ultrapassar as conhecidas limitações do protocolo de uCMS. Os resultados do estudo piloto foram avaliados para perceber se os critérios de validação propostos foram preenchidos. Para isso, um grupo de animais foi exposto ao protocolo automatizado (auCMS) e comparado com o grupo exposto ao protocolo manual (uCMS) e com o grupo controlo (CT). Alguns animais do grupo de auCMS foram tratados com um antidepressivo, a fluoxetina, para verificar a sua capacidade de reverter o fenótipo induzido. Os critérios de validação foram avaliados através de análises moleculares e celulares (critério de homologia), testes comportamentais (critério de semelhança) e eficácia do tratamento (critério de predição). A nível molecular, os níveis de corticosterona mostraram uma disrupção do padrão de secreção desta molécula nos animais expostos ao auCMS, tal como foi observado com o grupo uCMS. Relativamente à morfologia dos neurónios do giro dentado do hipocampo, ambos os grupos stressados (uCMS and auCMS) apresentaram resultados inconclusivos no que diz respeito ao comprimento das dendrites e à complexidade dos neurónios do giro denteado dorsal. Apesar da validação da componente molecular, o critério de homologia foi apenas parcialmente validado devido à falta de dados robustos na componente celular. O critério de semelhança (face validity) foi avaliado através de testes comportamentais para as 3 dimensões (cognição, ansiedade e humor), conhecidas por estar afetadas nesta doença. Resultados da cognição e ansiedade apresentaram diferenças significativas entre o grupo controlo e o grupo auCMS, com pior desempenho deste último grupo. A dimensão do humor foi avaliada através de 3 testes diferentes: SPT e SDT (testes anedónicos) que apenas mostraram diferenças significativas entre o grupo CT e o grupo uCMS; e pelo FST (teste de desamparo aprendido) que mostrou diferenças significativas entre o grupo controlo e o grupo auCMS. Estes resultados, pouco claros, podem estar relacionados com as dificuldades metodológicas deste tipo de testes. Apesar destas inconsistências, é possível alegar uma validade deste critério, visto que todos os testes comportamentais apresentaram piores desempenhos do grupo auCMS quando comparado com o grupo CT, sendo que naqueles onde não há estatística significativa existe uma tendência nesse sentido. Por último, uma parte dos animais do grupo auCMS foram tratados com fluoxetina e expostos aos mesmos testes comportamentais. Apesar de nem todos atingirem a validade estatística, os resultados mostram uma melhoria do grupo tratado em todos os testes, o que poderá ser considerado como um preenchimento do critério de predição. Para além destes critérios, Belzung introduziu outro conceito que pretende validar as estirpes usadas. O nosso estudo também teve em conta este parâmetro, uma vez que a nossa escolha recaiu nos Wistar Han – uma estirpe consensualmente aceite para estudar a depressão. No geral, tendo em conta os critérios de validação analisados os resultados revelaram-se promissores visto que a maioria dos resultados do protocolo automatizado revelaram uma resposta similar ao manual e divergente dos controlos. É importante não esquecer que este estudo piloto produziu resultados preliminares baseados num pequeno número de animais, o que levanta a necessidade de repetir a experiência para confirmar os resultados observados. Outra limitação está relacionada com a natureza em si de um estudo piloto, como foi o primeiro estudo desenvolvido com o equipamento algumas necessidades de aperfeiçoamento foram identificadas. Tal como esperado, ocorreram algumas falhas do equipamento assim como erros no protocolo programado; estas questões foram prontamente resolvidas mas ainda assim estes problemas podem ter influenciado a indução de stress nos animais e pode ter sido a causa para algumas alterações na aquisição do fenótipo. Apesar de este trabalho ter sido desenvolvido para estudar a depressão através de um protocolo de exposição a stress crónico, o equipamento apresentado pode ser usado para outras doenças uma vez que este é capaz de desenvolver outro tipo de protocolos. Nós acreditamos que esta inovação permitirá obter modelos animais mais robustos e fidedignos. De facto, modelos animais viáveis são cruciais para a investigação em ciências da saúde, particularmente para a melhoria das abordagens pré-clínicas atuais. Considero assim, que se deu um passo importante para o progresso no campo da investigação pré-clínica.
A depressão é uma doença psiquiátrica multidimensional que afeta cerca de 350 milhões de pessoas em todo o mundo. O uso de modelos animais é muito importante no contexto da investigação e desenvolvimento de novos medicamentos para tratar a depressão, na fase de ensaios pré-clínicos. No entanto, a criação de modelos animais de depressão válidos e eficazes tem sido um desafio para vários investigadores deste campo. Os modelos mais usados são baseados nos seguintes critérios de validação: semelhança (face validity), homologia (construct validity) e predição (predictive validity), validados por Willner. O critério de semelhança diz respeito à capacidade do modelo de mimetizar os principais sintomas da doença. O critério de homologia tem em consideração a fundamentação teórica por detrás das características observadas e o critério de predição avalia a correlação com a eficácia do tratamento na clínica. Há vários modelos animais de depressão, uns são baseados na exposição ao stress, outros em manipulações (bio)químicas, outros baseados em genética e há mesmo alguns derivados de lesões. Para estudos pré-clínicos os modelos baseados na exposição ao stress são os mais fidedignos porque permitem uma avaliação do fármaco num organismo, enquanto sistema integrado. Para além disso, o stress crónico moderado e imprevisível (uCMS) é um modelo amplamente utilizado pela sua similaridade etiológica com a doença humana e pelo preenchimento de todos os critérios de validação referidos. A principal fraqueza do modelo é a sua pouca reprodutibilidade entre laboratórios, muito provavelmente derivada da falta de padronização. Adicionalmente, trata-se de um modelo moroso, exigente do ponto de vista operacional e suscetível a variabilidade na execução do protocolo. Para ultrapassar estes problemas, a empresa onde desenvolvi esta tese de mestrado, Bn’ML – Behavior and Molecular Lab, desenvolveu um equipamento capaz de executar o protocolo de uCMS de uma forma padronizada e automatizada. Esta empresa é uma start-up da Universidade do Minho que trabalha na avaliação de efeitos comportamentais e moleculares de compostos terapêuticos, em modelos animais de doenças psiquiátricas. Este trabalho, desenvolvido no laboratório ICVS/3B’s - onde está incubada a Bn’ML, teve 2 objetivos principais: o primeiro foi o acompanhamento e supervisão da construção do protótipo assim como o teste e melhoramento individual dos stressores adaptados; o segundo foi a validação do protocolo de uCMS adaptado num estudo piloto utilizando um pequeno número de animais. No âmbito do primeiro objetivo concluímos a construção do protótipo (semelhante a uma rack) e conectámos este equipamento a um computador, o que permitiu a robotização de um processo que era integralmente executado pelo operador. De seguida reformulámos alguns dos stressores que fazem parte do protocolo de uCMS, para isso dividimo-los em três categorias principais: stressores totalmente automáticos, stressores parcialmente automáticos e stressores não automáticos. Os stressores totalmente automáticos foram introduzidos nas funções do equipamento - estes stressores são executados sem qualquer manipulação por parte do operador. Stressores parcialmente automáticos não são controlados pela rack mas a sua forma de implementação foi modificada de forma a ser adaptada a uma estrutura de mais fácil uso para o operador. Finalmente, stressores não automáticos refere-se aos que permaneceram iguais e portanto a sua execução foi exatamente igual à do protocolo original. Após provar que estes stressores adaptados desenvolviam a uma resposta ao stress similar aquela que ocorre em stressores originais (através do seu teste individual com animais), estes stressores foram integrados no equipamento para possibilitar o desenvolvimento de um protocolo completo, no formato de um estudo piloto. Para o segundo objetivo, integrámos todas as adaptações ao protocolo original (uCMS) num estudo piloto, o que nos possibilitou atingir resultados úteis e originais no que diz respeito às abordagens técnicas e metodológicas. Os principais resultados obtidos foram a redução do espaço necessário para executar este protocolo, a poupança de tempo, a diminuição da intensidade de trabalho, uma exposição mais uniforme das caixas dos animais ao protocolo (menos variabilidade), assim como a redução da manipulação dos animais. Estas alterações podem contribuir para ultrapassar as conhecidas limitações do protocolo de uCMS. Os resultados do estudo piloto foram avaliados para perceber se os critérios de validação propostos foram preenchidos. Para isso, um grupo de animais foi exposto ao protocolo automatizado (auCMS) e comparado com o grupo exposto ao protocolo manual (uCMS) e com o grupo controlo (CT). Alguns animais do grupo de auCMS foram tratados com um antidepressivo, a fluoxetina, para verificar a sua capacidade de reverter o fenótipo induzido. Os critérios de validação foram avaliados através de análises moleculares e celulares (critério de homologia), testes comportamentais (critério de semelhança) e eficácia do tratamento (critério de predição). A nível molecular, os níveis de corticosterona mostraram uma disrupção do padrão de secreção desta molécula nos animais expostos ao auCMS, tal como foi observado com o grupo uCMS. Relativamente à morfologia dos neurónios do giro dentado do hipocampo, ambos os grupos stressados (uCMS and auCMS) apresentaram resultados inconclusivos no que diz respeito ao comprimento das dendrites e à complexidade dos neurónios do giro denteado dorsal. Apesar da validação da componente molecular, o critério de homologia foi apenas parcialmente validado devido à falta de dados robustos na componente celular. O critério de semelhança (face validity) foi avaliado através de testes comportamentais para as 3 dimensões (cognição, ansiedade e humor), conhecidas por estar afetadas nesta doença. Resultados da cognição e ansiedade apresentaram diferenças significativas entre o grupo controlo e o grupo auCMS, com pior desempenho deste último grupo. A dimensão do humor foi avaliada através de 3 testes diferentes: SPT e SDT (testes anedónicos) que apenas mostraram diferenças significativas entre o grupo CT e o grupo uCMS; e pelo FST (teste de desamparo aprendido) que mostrou diferenças significativas entre o grupo controlo e o grupo auCMS. Estes resultados, pouco claros, podem estar relacionados com as dificuldades metodológicas deste tipo de testes. Apesar destas inconsistências, é possível alegar uma validade deste critério, visto que todos os testes comportamentais apresentaram piores desempenhos do grupo auCMS quando comparado com o grupo CT, sendo que naqueles onde não há estatística significativa existe uma tendência nesse sentido. Por último, uma parte dos animais do grupo auCMS foram tratados com fluoxetina e expostos aos mesmos testes comportamentais. Apesar de nem todos atingirem a validade estatística, os resultados mostram uma melhoria do grupo tratado em todos os testes, o que poderá ser considerado como um preenchimento do critério de predição. Para além destes critérios, Belzung introduziu outro conceito que pretende validar as estirpes usadas. O nosso estudo também teve em conta este parâmetro, uma vez que a nossa escolha recaiu nos Wistar Han – uma estirpe consensualmente aceite para estudar a depressão. No geral, tendo em conta os critérios de validação analisados os resultados revelaram-se promissores visto que a maioria dos resultados do protocolo automatizado revelaram uma resposta similar ao manual e divergente dos controlos. É importante não esquecer que este estudo piloto produziu resultados preliminares baseados num pequeno número de animais, o que levanta a necessidade de repetir a experiência para confirmar os resultados observados. Outra limitação está relacionada com a natureza em si de um estudo piloto, como foi o primeiro estudo desenvolvido com o equipamento algumas necessidades de aperfeiçoamento foram identificadas. Tal como esperado, ocorreram algumas falhas do equipamento assim como erros no protocolo programado; estas questões foram prontamente resolvidas mas ainda assim estes problemas podem ter influenciado a indução de stress nos animais e pode ter sido a causa para algumas alterações na aquisição do fenótipo. Apesar de este trabalho ter sido desenvolvido para estudar a depressão através de um protocolo de exposição a stress crónico, o equipamento apresentado pode ser usado para outras doenças uma vez que este é capaz de desenvolver outro tipo de protocolos. Nós acreditamos que esta inovação permitirá obter modelos animais mais robustos e fidedignos. De facto, modelos animais viáveis são cruciais para a investigação em ciências da saúde, particularmente para a melhoria das abordagens pré-clínicas atuais. Considero assim, que se deu um passo importante para o progresso no campo da investigação pré-clínica.
Descrição
Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017
Palavras-chave
Depression Animal model Validation Stress Teses de mestrado - 2017