Physiopathology and clinical implications of the RANK c.1386C>T (R450W) mutation in breast cancer patients

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RANK signaling pathway as a mediator of resistance to targeted therapies in breast cancer

Publication . Gomes, Inês Fernandes; Casimiro, Sandra Cristina Cara de Anjo; Costa, Luís António Marques da

Despite the efficacy of local treatments to control early breast cancer (BC) and great advances in the development of target therapies, relapse and progression rates are still high, mostly due to (neo)adjuvant systemic therapy resistance. Therefore, it is extremely important to unravel drivers of therapeutic resistance and devise strategies to overcome it. The receptor activator of nuclear factor-kB (RANK)-RANK ligand (RANKL) signaling pathway is a key regulator of several physiopathological processes, including osteoclastogenesis, breast carcinogenesis and BC progression. In this work, we provide the first characterization of RANK overexpressing (RANK OE) luminal BC, including its effect in response to standard of care therapies. We found that RANK OE luminal BC is characterized by a staminal and mesenchymal phenotype and decreased proliferation rate. Moreover, RANK OE cells were more invasive and less sensitive to chemo, endocrine and cyclin dependent kinase 4 and 6 inhibitors (CDK4/6i) therapy. Additionally, we disclose the mechanism(s) involved in RANK-mediated resistance to CDK4/6i and demonstrate that the pharmacological inhibition of RANK-RANKL pathway may improve the efficacy of this class of drugs. Major RANK-associated intrinsic or acquired resistance drivers were the decreased proliferation rate and chronic interferon γ-response activation, characteristic of luminal RANK OE cells and tumors. Importantly, RANKL inhibitors (RANKLi) restored sensitivity and prevented acquired resistance to CDK4/6i. Stemming from these findings, we also demonstrate that the genetic or pharmacologic inhibition of RANK-pathway improves the response to CDK4/6i of Rb-proficient TNBC, where current therapeutic options are mostly limited to chemotherapy. Overall, our results advanced the current knowledge about the role of RANK pathway in BC, clearly implicated in luminal BC biology. Moreover, this work has a strong translational value, showing that the use of RANKLi may span far beyond its current use in the clinics as a bone target therapy, and be repurposed as a new add-on to CDK4/6i in the treatment of metastatic luminal and TNBC patients.

2023-12Doctoral thesis

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Sensitivity profile of triple-negative breast cancer cell lines to combination therapies including RANKL blockade

Publication . Belo, João Brito Colaço Carvalho; Casimiro, Sandra Cristina Cara de Anjo,1973-; Caria, Maria Helena

O cancro da mama (CM) é o cancro com a segunda mais elevada mortalidade a nível mundial. Dada a heterogeneidade que apresenta, é classificado em subtipos de acordo com a expressão de determinados recetores moleculares, de modo a permitir uma maior especificidade, e consequentemente eficácia, no tratamento dos pacientes. Um dos subtipos definidos é o CM triplo negativo (TNBC, do inglês triple- -negative breast cancer), caraterizado pela ausência de expressão de recetores de progesterona (RP) e de recetores de estrogénio (RE), e ainda por não apresentar amplificação do recetor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). O TNBC constitui cerca de 10% a 15% dos casos de CM e está associado a um prognóstico pior do que os restantes subtipos, possuindo os pacientes taxas de sobrevivência inferiores e maior probabilidade de recidiva. Apesar de o TNBC apresentar uma elevada sensibilidade à quimioterapia, sendo esta a terapia padrão para os doentes com TNBC, a aquisição de mecanismos de resistência explica as recidivas e pior prognóstico observados. Deste modo, é necessária a investigação de novas abordagens clínicas direcionadas que reduzam o impacto negativo do TNBC na sociedade. Os inibidores da poli-(ADP-ribose) polimerase (PARP) (iPARP) são uma classe de fármacos que afeta a reparação de quebras simples da cadeia de DNA (SSB, do inglês single strand breaks). Em paralelo, CM com mutações nos genes BRCA1 e/ou BRCA2 tendem a perder o alelo saudável, o que lhes confere deficiência na reparação por recombinação homóloga (HRR, do inglês homologous recombination repair), impedindo a correção de quebras duplas da cadeia de DNA (DSB, do inglês double strand breaks). Estes dois défices resultam eventualmente em apoptose. O olaparib é um iPARP aprovado para tratamento de CM, nomeadamente em doentes com CM HER2- metastático ou avançado com mutações germinais em BRCA1/2 e de doentes com CM com recetores hormonais (RH) não responsivos a terapia hormonal (TH). É possível que outros doentes com TNBC beneficiem do olaparib, particularmente com tumores possuindo mutações somáticas em BRCA1/2 ou metilação do promotor destes genes. Por outro lado, os inibidores da fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K) (iPI3K) são fármacos que atuam ao nível da via do PI3K/Akt/mTOR, que é uma via de sinalização frequentemente mutada em CM, incluindo TNBC. Enquanto que o PI3K promove a ativação da quinase Akt, a fosfatase homóloga à tensina (PTEN) regula negativamente este processo, estando associada a funções de supressão tumoral. Recentemente, foi aprovado um iPI3K, o alpelisib, para tratamento de doentes com CM RE+, RP+, HER2- metastático ou avançado com mutações no gene PIK3CA e após progressão sob TH. Este inibidor apresenta especificidade para a isoforma α do PI3K, cuja subunidade catalítica é codificada pelo gene PIK3CA, e atua através de um mecanismo pró-apoptótico. É possível que o alpelisib tenha utilidade no tratamento de doentes com TNBC com mutações ao nível do PIK3CA. Curiosamente, foi previamente descrita uma sinergia entre iPARP e iPI3K em modelos de TNBC, o que levou a um ensaio clínico que pretendeu testar a combinação de olaparib com os iPI3K buparlisib ou alpelisib em doentes com TNBC recorrente ou cancro ovárico seroso de alto grau. Este ensaio demonstrou existir sinergia entre olaparib e alpelisib em cancro ovárico HRR-competente. O mesmo poderá ser verdade para TNBC BRCA-competente, e talvez especialmente em doentes com mutações no PIK3CA. O ligando do recetor ativador do fator nuclear kappa B (RANKL) é uma proteína homotrimérica pertencente à superfamília dos fatores de necrose tumoral (TNF, do inglês tumour necrosis factors) e que pode existir na forma membranar ou solúvel. O RANKL liga-se ao recetor RANK, um recetor homotrimérico transmembranar que requer proteínas adaptadoras para ser funcional. Destas, destaca-se o fator associado a TNF 6 (TRAF6), que tem um envolvimento crucial na ativação de vias a jusante de RANKL/RANK, nomeadamente as vias do PI3K/Akt/mTOR, das proteínas quinases ativadas por mitogénios (MAPKs), e da Src/fosfolipase gamma (PLCγ). Esta cascata de transdução de sinal resulta na promoção da sobrevivência, diferenciação e proliferação celulares devido à translocação nuclear de ativadores transcricionais, nomeadamente o NF-κB. A via de sinalização RANKL/RANK é negativamente regulada pela osteoprotegerina (OPG), um recetor “engodo” que é capaz de se ligar ao RANKL com uma afinidade largamente superior à que o RANK apresenta. A via do RANKL/RANK está envolvida em diversos processos fisiológicos, sendo de ressalvar a importância crucial na manutenção da homeostase óssea. Uma outra função crítica desta via ocorre ao nível do tecido mamário, nomeadamente promovendo a morfogénese da glândula mamária durante a gravidez. A progesterona possui um efeito mitogénico nas células epiteliais mamárias, ligando-se ao RP de células epiteliais luminais e promovendo um aumento da expressão de RANKL. Esta citocina vai interagir com células RANK+, tanto basais como luminais, e promover fenómenos de proliferação e sobrevivência. De destaque, há duas cascatas de sinalização envolvidas neste processo, uma resultando na transcrição da ciclina D1 dependente do NF-κB, e outra resultando na redução da transcrição da p21 mediada pelo inibidor da proteína DNA binding 2 (Id2). No contexto oncológico, já foi observada expressão de RANK e RANKL em diversos tumores humanos e, inclusive, foram propostas associações preditivas de mau prognóstico. O envolvimento da via RANKL/RANK neste contexto foi já descrito ao nível da promoção da transição epitélio-mesênquima (TEM), migração celular, neovascularização tumoral, estabelecimento de metástases à distância, imunossupressão, entre outros. Um dos cancros em que foi estabelecida uma relação entre esta via e a carcinogénese é o CM – tendo sido destacado o envolvimento da progesterona e derivativos sintéticos. Para além disso, foi ainda identificado o papel crucial do eixo progesterona/RANKL na tumorigénese de CM com mutações em BRCA1, que são maioritariamente TNBC. Ainda no contexto do CM, a via RANKL/RANK está por detrás do ciclo vicioso que se observa frequentemente nas metástases ósseas, em que ocorre uma promoção descontrolada da reabsorção óssea, criando no osso um nicho favorável ao estabelecimento das células tumorais. A via RANKL/RANK é, deste modo, um alvo terapêutico emergente tanto ao nível do TNBC como do CM no geral. Entre 2010 e 2011, foi aprovado para utilização clínica um anticorpo monoclonal anti- -RANKL totalmente humanizado, denosumab, sendo atualmente utilizado em doentes com CM sob terapia de ablação hormonal e em contexto de doença metastática óssea. Tendo sido previamente observado um efeito do bloqueio do RANKL in vitro na prevenção da tumorigénese de CM mutado em BRCA1, é possível que este bloqueio se possa demonstrar vantajoso em TNBC quando integrado em abordagens terapêuticas combinatórias. Neste projeto, colocámos a hipótese de que a inibição farmacológica da via RANKL/RANK, através do bloqueio do RANKL, poderia apresentar sinergia com iPARP, como o olaparib, e/ou iPI3K, como o alpelisib, no contexto do TNBC. Considerando que o TNBC pode expressar RANK e RANKL, e que uma maior expressão destas proteínas poderá estar associada a uma maior suscetibilidade ao bloqueio por RANKL, começámos por avaliar a expressão de ambas num painel de linhas celulares TNBC (BT-20, HCC1937, MDA-MB-231 e MDA-MB-468). De seguida, de modo a justificar uma abordagem de inibição da via RANKL/RANK, foi confirmada a ativação da via por RANKL exógeno, nomeadamente a fosforilação de proteínas a jusante da via como p-65, Erk e Akt. Para realizar o bloqueio do RANKL, foi selecionada a proteína recombinante OPG-Fc, que confirmámos ser capaz de inibir a ativação da via pelo RANKL. Estando verificada a possibilidade da abordagem inibitória, foram primeiramente realizados ensaios de viabilidade celular após 72 horas de exposição a olaparib, alpelisib e OPG-Fc, em regime individual. As diferentes linhas celulares mostraram-se, na sua maioria, resistentes ao olaparib, mas sensíveis ao tratamento com alpelisib, embora a diferentes níveis. A OPG-Fc não mostrou afetar, per se, a viabilidade celular. Finalmente, de modo a verificar o efeito do bloqueio do RANKL quando em combinação com olaparib e/ou alpelisib, foram realizados ensaios de viabilidade envolvendo combinações duplas de olaparib e OPG-Fc ou alpelisib e OPG-Fc; e combinações triplas de olaparib, alpelisib e OPG-Fc. Nenhuma das referidas combinações se mostrou significativamente vantajosa em termos de redução da viabilidade celular quando comparados os regimes com e sem OPG-Fc. Foi confirmado por análise de expressão proteica que o olaparib e o alpelisib estavam, de facto a afetar os respetivos alvos moleculares, confirmando-se assim que a adição de OPG-Fc não foi eficaz no contexto das células TNBC avaliadas. Apesar dos resultados obtidos, a inibição da via do RANKL/RANK continua a ser um alvo terapêutico importante no âmbito do TNBC, existindo evidências pré-clínicas de sinergia do bloqueio do RANKL com inibidores de checkpoints do sistema imunitário.

2020Master thesis

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Altered expression of proteins in cancer: function and potential therapeutic targets

Publication . Pessoa, João; Martins, Marta; Casimiro, Sandra; Pérez-Plasencia, Carlos; Shoshan-Barmatz, Varda

The design of innovative cancer treatments requires extensive characterization of the molecular and cellular alterations associated with tumor development and progression. Cancer cells show extensive alterations in protein expression levels, which are drivers of their malignant transformation. Proteins with altered expression levels in cancer are involved in protein synthesis and degradation, signaling and metabolic pathways, DNA repair, apoptosis, and other cellular processes, whose alterations cause tumor development and progression. Characterizing the mechanisms that lead to alterations in protein levels and their cellular effects is an invaluable tool for repurposing those proteins as drug targets. Examples of up-regulated proteins in cancer include the epidermal growth factor receptor 2 (HER2) and the vascular endothelial growth factor (VEGF). HER2 is up-regulated in several cancer types, including breast, gastroesophageal, and non-small-cell lung cancers, making it an effective drug target. VEGF is up-regulated in pancreatic, prostate, and colorectal cancers, among others. Its inhibition is also an effective anticancer treatment, through a decrease in tumor vascularization.These examples demonstrate the modulation of protein levels as an effective anticancer target, which is becoming widely used in patient treatments. These studies also encourage additional research to uncover and test novel up-/down-regulated proteins as potential new therapeutic targets.

2022Journal article

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The roadmap of RANKL/RANK pathway in cancer

Publication . Casimiro, Sandra; Vilhais, Guilherme; Fernandes Gomes, Inês; Costa, Luis

The receptor activator of the nuclear factor-κB ligand (RANKL)/RANK signaling pathway was identified in the late 1990s and is the key mediator of bone remodeling. Targeting RANKL with the antibody denosumab is part of the standard of care for bone loss diseases, including bone metastases (BM). Over the last decade, evidence has implicated RANKL/RANK pathway in hormone and HER2-driven breast carcinogenesis and in the acquisition of molecular and phenotypic traits associated with breast cancer (BCa) aggressiveness and poor prognosis. This marked a new era in the research of the therapeutic use of RANKL inhibition in BCa. RANKL/RANK pathway is also an important immune mediator, with anti-RANKL therapy recently linked to improved response to immunotherapy in melanoma, non-small cell lung cancer (NSCLC), and renal cell carcinoma (RCC). This review summarizes and discusses the pre-clinical and clinical evidence of the relevance of the RANKL/RANK pathway in cancer biology and therapeutics, focusing on bone metastatic disease, BCa onset and progression, and immune modulation.

2021Journal article

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Expression of receptor activator of NFkB (RANK) drives stemness and resistance to therapy in ER+HER2- breast cancer

Publication . Fernandes Gomes, Inês; Almeida, Bernardo P. De; Dâmaso, Sara; Mansinho, André; Correia, Inês; Henriques, Sara; Duarte, Raquel; Vilhais, Guilherme; Félix, Pedro; Alves, Patrícia; Corredeira, Patrícia; Barbosa-Morais, Nuno; Costa, Luis; Casimiro, Sandra

The role of RANKL-RANK pathway in progesterone-driven mammary carcinogenesis and triple negative breast cancer tumorigenesis has been well characterized. However, and despite evidences of the existence of RANK-positive hormone receptor (HR)-positive breast tumors, the implication of RANK expression in HR-positive breast cancers has not been addressed before. Here, we report that RANK pathway affects the expression of cell cycle regulators and decreases sensitivity to fulvestrant of estrogen receptor (ER)-positive (ER+)/HER2- breast cancer cells, MCF-7 and T47D. Moreover, RANK overexpressing cells had a staminal and mesenchymal phenotype, with decreased proliferation rate and decreased susceptibility to chemotherapy, but were more invasive in vivo. In silico analysis of the transcriptome of human breast tumors, confirmed the association between RANK expression and stem cell and mesenchymal markers in ER+HER2- tumors. Importantly, exposure of ER+HER2- cells to continuous RANK pathway activation by exogenous RANKL, in vitro and in vivo, induced a negative feedback effect, independent of RANK levels, leading to the downregulation of HR and increased resistance to hormone therapy. These results suggest that ER+HER2- RANK-positive cells may constitute an important reservoir of slow cycling, therapy-resistance cancer cells; and that RANK pathway activation is deleterious in all ER+HER2- breast cancer cells, independently of RANK levels.

2020Journal article

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