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Projeto de investigação
Multifunctional nano-immunotherapy for melanoma brain metastases treatment
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Regulation of breast cancer extracellular matrix to boost breast cancer immunity
Publication . Santos, Ana Carolina Branco; Ferreira, Helena Isabel Fialho Florindo Roque; Matos, Ana Isabel Neves de
O cancro da mama é um dos tipos de cancro mais frequentemente detetados em mulheres. Os cancros luminais são os cancros de mama mais comuns, onde o luminal B apresenta alta agressividade e genes relacionados à proliferação tumoral.
O desenvolvimento do cancro da mama está associado aos fatores celulares e solúveis da matriz extracelular (ECM). A ECM promove a migração celular conectando o citoesqueleto das células com aderências focais (FA). A presença de FA está relacionada com a fosforilação da tirosina, sendo a quinase de adesão focal (FAK) uma das mais prontamente fosforiladas no cancro. A superexpressão de FAK está associada à proliferação de células tumorais, contribuindo também para a ativação das células endoteliais, que expressam a P-selectina na sua superfície. A ação da P-selectina é desencadeada pela sua interação com o ligando-1 da glicoproteína P-selectina (PSGL-1) expresso nas células tumorais, promovendo a circulação de células cancerígenas e metástase.
Como a interação entre FAK e P-selectina é pouco compreendida, este projeto tem como objetivo avaliar o efeito antitumoral sinérgico da interação entre os inibidores da FAK e da P-selectina e a nanovacina direcionadas a DC que entregam antígenos associados a tumores e adjuvantes, em modelos esferóides 3D.
A expressão de FAK, FAK fosforilada (pFAK), P-selectina e PSGL-1 foram avaliadas em células EO771 e do microambiente tumoral (TME) recolhidas de ratinhos inoculados com EO771. Verificou-se que FAK, pFAK e P-selectina estavam superexpressas em células EO771 TME (> 97%). Para modular o TME em direção a um microambiente efetor imunológico, antes de avaliar o papel do defactinib (inibidor da FAK) e do KF-38789 (inibidor da P-selectina) na função e frequência das células imunes dentro do TME, avaliámos o impacto do defactinib e do KF-38789 na viabilidade das células EO771 e TME EO771. Consequentemente, o defactinib e o KF-38789 induziram um efeito citotóxico significativo nas células EO771 para concentrações acima de 1 e 0,1 μM, respetivamente. Além disso, foi obtida uma diminuição significativa na viabilidade das células EO771 TME para concentrações de defactinib e KF-38789 acima de 0,5 e 0,05 µM, respetivamente. Finalmente, para avaliar o impacto do efeito sinérgico entre a inibição da FAK e da P-selectina combinada com a nanovacina, foi realizada a co-cultura dos esferóides 3D de tumores EO771 (EO771 TME) e esplenócitos. De acordo com as diferentes condições, o tratamento de esferóides 3D do cancro da mama com KF-38789 e a nanovacina isoladamente ou em combinação com o tratamento com defactinib mostrou-se promissor na modulação da invasão tumoral. Finalmente, uma inibição completa do sprouting resultando na morte de células esferóides 3D foi alcançada com a combinação de defactinib e esplenócitos estimulados seguido de KF-38789, representando o efeito sinérgico mais promissor entre os tratamentos testados. Considerando a estratégia terapêutica mais promissora e eficaz, levanta-se a hipótese de que o defactinib primeiro modula o TME para permitir uma melhor infiltração imunológica desencadeada pela vacinação, enquanto a P-selectina previne a proliferação de células cancerígenas.
Therapeutic targeting of PD-1/PD-L1 blockade by novel small-molecule inhibitors recruits cytotoxic T cells into solid tumor microenvironment
Publication . Acúrcio, Rita C; Pozzi, Sabina; Carreira, Barbara; Pojo, Marta; Gómez-Cebrián, Nuria; Casimiro, Sandra; Fernandes, Adelaide; Barateiro, Andreia; Farricha, Vitor; Soares Do Brito, Joaquim; Leandro, P; Salvador, Jorge A. R.; Graca, Luis; Puchades-Carrasco, Leonor; Costa, Luis; Satchi-Fainaro, Ronit; Guedes, R. C.; Florindo, Helena F
Background: Inhibiting programmed cell death protein 1 (PD-1) or PD-ligand 1 (PD-L1) has shown exciting clinical outcomes in diverse human cancers. So far, only monoclonal antibodies are approved as PD-1/PD-L1 inhibitors. While significant clinical outcomes are observed on patients who respond to these therapeutics, a large proportion of the patients do not benefit from the currently available immune checkpoint inhibitors, which strongly emphasize the importance of developing new immunotherapeutic agents.
Methods: In this study, we followed a transdisciplinary approach to discover novel small molecules that can modulate PD-1/PD-L1 interaction. To that end, we employed in silico analyses combined with in vitro, ex vivo, and in vivo experimental studies to assess the ability of novel compounds to modulate PD-1/PD-L1 interaction and enhance T-cell function.
Results: Accordingly, in this study we report the identification of novel small molecules, which like anti-PD-L1/PD-1 antibodies, can stimulate human adaptive immune responses. Unlike these biological compounds, our newly-identified small molecules enabled an extensive infiltration of T lymphocytes into three-dimensional solid tumor models, and the recruitment of cytotoxic T lymphocytes to the tumor microenvironment in vivo, unveiling a unique potential to transform cancer immunotherapy.
Conclusions: We identified a new promising family of small-molecule candidates that regulate the PD-L1/PD-1 signaling pathway, promoting an extensive infiltration of effector CD8 T cells to the tumor microenvironment.
Regulation of the immune response against pancreatic cancer
Publication . Mendes, Nicole de Jesus; Ferreira, Helena Isabel Fialho Florindo Roque; Acúrcio, Ana Rita de Carvalho
O cancro do pâncreas é a 7ª principal causa de morte em homens e mulheres. A sua incidência está a aumentar, e espera-se que se torne a segunda maior causa de morte por cancro nos países ocidentais até 2030. Cerca de 90% dos cancros pancreáticos são do tipo adenocarcinoma ductal do pâncreas (PDAC), e a maioria dos diagnósticos é feita quando o tumor primário já metastizou para diversos locais do organismo. Por isso, nestes casos, a cirurgia deixa de ser uma opção terapêutica. A metastização em PDAC ocorre com frequência através da vasculatura e nódulos linfáticos, estando fortemente correlacionada com um mau prognóstico.
O PDAC é composto não só por células tumorais, mas também por uma matriz desmoplásica densa, o estroma. Este é um dos alicerces do desenvolvimento, disseminação, metástase e resistência ao tratamento do PDAC. Os seus componentes - fibroblastos associados ao cancro (CAFs), matriz extracelular (ECM), células estreladas pancreáticas (PSCs), células endoteliais, células imunitárias, e fatores de crescimento - parecem ter papéis fundamentais no microambiente tumoral (TME).
Durante a formação inicial do tumor, a interação tumor-estroma conduz à reprogramação de células mesenquimais, incluindo as PSCs, em CAFs. Estas podem desempenhar numerosas funções anti e pró-tumorigénicas no TME, sendo também a fonte primária dos componentes fibróticos do estroma. A fibrose contribui para a diminuição do espaço intersticial, levando uma baixa infiltração de células imunitárias no tumor e uma diminuição da eficácia dos fármacos. Os CAFs também produzem várias quimiocinas, citocinas, fatores de crescimento, microRNAs (miRNAs), e outros metabolitos que podem estimular as células tumorais e TME, contribuindo para o estabelecimento e progressão do tumor.
A proteína tirosina quinase de adesão focal (FAK) é uma das moléculas centrais envolvidas no desenvolvimento do estroma, estando associada ao recrutamento e ativação dos CAFs no TME do PDAC. A FAK tem também um papel fundamental na regulação do perfil imunológico do PDAC (aumento das células T reguladoras) e nos processos de angio e linfangiogénese, através da mediação das interações entre as células tumorais e as células vasculares endoteliais sanguíneas e linfáticas (BEC e LEC, respetivamente). A FAK interage com recetor 3 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR3). Este fator de crescimento está aumentado no estroma do PDAC, principalmente nas LEC. Adicionalmente, nas células tumorais do PDAC, há uma sobre-expressão dos ligandos do VEGFR3, nomeadamente VEGF-C e VEGF-D, o que favorece o desenvolvimento da vasculatura linfática e promove a metastização do tumor para os nódulos linfáticos. O eixo VEGF-C, VEGF-D/VEGFR3 desempenha um papel importante na resistência à quimioterapia. O composto SAR131675 é um inibidor seletivo do grupo tirosina quinase (TK) do VEGFR3, e é conhecido por ter ação antitumoral, antilinfangiogénica e antimetastática.
A sobre expressão da FAK tem sido assim associada a um pior prognóstico dos doentes com PDAC e foi demonstrado que existe uma correlação entre esta e o tamanho do tumor. A utilização do Defactinib, um inibidor da FAK (FAKi) com potencial atividade antiangiogénica e antineoplásica, reduziu a proliferação de células PDAC. A combinação de inibidores da FAK e moduladores dos checkpoints imunológicos reduziu o tamanho do PDAC e prolongou a vida de murganhos nos quais este tumor foi induzido. A modulação de interações proteína-proteína específicas da FAK também demonstrou resultados encorajadores em vários modelos de cancro, incluindo PDAC. No entanto, o impacto da FAK na complexa interação CAF-tumor-vasculatura-células imunológicas ainda não está bem estabelecido e poderá fornecer informação fundamental para a otimização de esquemas terapêuticos eficazes contra PDAC.
No geral, esta tese centra-se na hipótese de que a modulação da expressão de FAK e VEGFR3 no TME pode potenciar a resposta imunológica induzida por uma nanovacina, ultrapassando os mecanismos imunossupressores associados a tumores, aumentando o recrutamento de células T para a interior massa tumoral sólida. Para confirmar esta hipótese, seguiremos uma abordagem iterativa avaliando o impacto da inibição de FAK e VEGFR3 na função de diferentes subpopulações presentes nas culturas celulares de esplenócitos e do TME obtidas a partir de ratinhos vacinados e não vacinados.
Precision nanotechnology-based therapeutic approaches to enhance tumor-immune cells crosstalk within melanoma stromal microenvironment
Publication . Carreira, Barbara; Ferreira, Helena Isabel Fialho Florindo Roque; Satchi-Fainaro, Ronit
Despite the remarkable efficiency of immune checkpoint modulators against metastatic melanoma, only a small percentage of patients respond to these therapies. Among the responders, clinical trials report immune-mediated side effects and disease relapse. Immune checkpoint inhibitors inefficiency is being attributed to tumor-related immunosuppression pathways and limited infiltration of effector T cells. To overcome these limitations, new synergistic strategies are urgently needed.
To that end, we focused on the development of a precision nanosystem based therapy to specifically target dendritic cells (DC) and successfully modulate melanoma-immune cell interactions by expanding the range of targeted cells in a site-specific manner. For this purpose, we designed, synthesized, and characterized poly(lactic acid) and poly(lactic-co-glycol) (PLA/PLGA)-based nano-vaccines using mannose-grafted polymers to deliver combinations of melanoma neoantigen, toll-like receptor ligands, and regulators of the PD-1/PD-L1 pathway. These cancer nano-vaccinesamplified antitumor immune responses by increasing tumor-associated antigen recognition, processing, and presentation to effector T cells. The polymeric nanoparticles presented spherical shape with an average diameter of 180 nm, displaying a narrow polydispersity index, near-neutral surface charge, and high loadings of the immune regulators. Both subcutaneous and intranasal immunizations induced the activation and maturation of DC within draining lymph nodes and triggered the systemic activation of neoantigen-specific cytotoxic T cells.
Treatment with the combination of the therapeutic nano-vaccineswith PD-1/PD-L1 modulators in vivo led to increased tumor inhibition in orthotopic primary melanoma-bearing mice, with minimal systemic toxicity. The combination of the nano-vaccine with the PD-L1 monoclonal antibody was the most effective, with maximal tumor growth inhibition, translated into extensive infiltration of cytotoxic CD8+ T cells into the tumor microenvironment and reduced expression of immunosuppressor cells. At the metastatic disease, followed by primary tumor resection, the intranasal immunization of the therapeutic nano-vaccine combined with the PD-L1 immune checkpoint inhibitor led to the prevention of melanoma brain metastases. The combination strategy led to 100% survival at 52 days followed intracranial tumor inoculation and recapitulation into a T-cell inflamed brain tumor microenvironment. Altogether, the synergy between the nano-vaccine and the PD-L1 antibody provides essential insights to devise alternative combination regimens to improve the efficacy of immune checkpoint inhibitors in metastatic melanoma, thus opening a new line for polymeric nano-vaccines as a potential tool to advance clinical response to advanced melanoma.
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Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
3599-PPCDT
Número da atribuição
PTDC/BTM-SAL/4350/2021