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Downregulated glia interplay and increased miRNA-155 as promising markers to track ALS at an early stage

Publication . Cunha, Carolina; Santos, Catarina; Gomes, Cátia; Fernandes, Adelaide; Marcal Correia, Alexandra; Sebastião, Ana M; Vaz, Ana R; Brites, Dora

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease of unknown cause. Absence of specific targets and biomarkers compromise the development of new therapeutic strategies and of innovative tools to stratify patients and assess their responses to treatment. Here, we investigate changes in neuroprotective-neuroinflammatory actions in the spinal cord of SOD1 G93A mice, at presymptomatic and symptomatic stages to identify stage-specific biomarkers and potential targets. Results showed that in the presymptomatic stage, there are alterations in both astrocytes and microglia, which comprise decreased expression of GFAP and S100B and upregulation of GLT-1, as well as reduced expression of CD11b, M2-phenotype markers, and a set of inflammatory mediators. Reduced levels of Connexin-43, Pannexin-1, CCL21, and CX3CL1 further indicate the existence of a compromised intercellular communication. In contrast, in the symptomatic stage, increased markers of inflammation became evident, such as NF-κB/Nlrp3-inflammasome, Iba1, pro-inflammatory cytokines, and M1-polarizion markers, together with a decreased expression of M2-phenotypic markers. We also observed upregulation of the CX3CL1-CX3CR1 axis, Connexin-43, Pannexin-1, and of microRNAs (miR)-124, miR-125b, miR-146a and miR-21. Reduced motor neuron number and presence of reactive astrocytes with decreased GFAP, GLT-1, and GLAST further characterized this inflammatory stage. Interestingly, upregulation of miR-155 and downregulation of MFG-E8 appear as consistent biomarkers of both presymptomatic and symptomatic stages. We hypothesize that downregulated cellular interplay at the early stages may represent neuroprotective mechanisms against inflammation, SOD1 aggregation, and ALS onset. The present study identified a set of inflamma-miRNAs, NLRP3-inflammasome, HMGB1, CX3CL1-CX3CR1, Connexin-43, and Pannexin-1 as emerging candidates and promising pharmacological targets that may represent potential neuroprotective strategies in ALS therapy.

2017Journal article

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Metabolic cues in cancer diagnosis and therapeutics

Publication . Marques, Vanda; Rodrigues, Cecília Maria Pereira; Afonso, Marta Bento; Saraiva, Lucília Helena Ataíde

The worldwide social and economic impact of cancer keeps increasing and proper disease management is a critical step to reducing the cancer burden on society, where appropriate diagnosis, staging, and treatment are key factors. Concomitantly, the increasing prevalence of obesity brings forward its importance as a risk factor for cancer development but also allows to explore associated metabolites and signaling pathways as tools for cancer research. As such, the studies presented in this thesis aim to tackle two pillars in cancer research: early diagnosis and therapy resistance, by exploring metabolism-related hormones as disease biomarkers and their impact on resistance to chemoradiotherapy, as well as unraveling novel molecules targeting cancer stem cells as major culprits in refractory cancer. In our first study, we focused on nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) as a predisposing risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. Our goal was to evaluate serum levels of metabolism hormones as non-invasive biomarkers aiming to produce diagnostic options alternative to liver biopsy. Using two independent cohorts of biopsy-proven obese NAFLD patients and healthy-liver controls, we measured adiponectin, leptin, and insulin-like growth factor 1 (IGF-1) serum levels. Leptin serum levels were able to discriminate NAFLD with obesity posing as a potential confounding factor. Adiponectin serum levels combined with specific serum lipids composed a biomarker panel with good assay performance for the stratification of nonalcoholic steatohepatitis versus nonalcoholic fatty liver, however, it can be influenced by the presence of patatin-like phosphate domain-containing protein 3 (PNPLA3) genetic polymorphisms. In turn, IGF-1 levels combined with INR and ferritin were able to distinguish advanced liver fibrosis outranking other fibrosis evaluation scores used in the clinical practice. Next, we followed to evaluate how adiponectin and leptin modulated cell stemness and influenced resistance to chemoradiotherapy in rectal cancer patients, and ultimately providing novel biomarker candidates to identify patients not responding to neoadjuvant therapy. By evaluating serum and biopsy tissue from a cohort of locally advanced rectal cancer, we observed that leptin and adiponectin serum levels were not able to identify non-responder patients to chemoradiotherapy. Yet, high leptin and low adiponectin levels were associated with worsened clinical outcomes and unfavorable patient survival. At a molecular level, leptin serum profile was associated with increased expression of Yamanaka factors mRNA, particularly of octamer-binding transcription factor 4 (OCT4) and Kruppel-like factor 4 (KLF4), as well as signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) activation in the biopsy tissues, and all three parameters tended to increase in non-responders. Bringing together STAT3 activation, OCT4, and KLF4 mRNA expression with carcinoembryonic antigen levels – the only serological parameter that distinguished responders from non-responders – we were able to establish a high-performance biomarker panel to distinguish rectal cancer patient responders versus non-responders to chemoradiotherapy. In our third study, we focused on cancer stem cells as a cause of cancer relapse and resistance to therapy. Taking advantage of in vitro tumorsphere forming assays, we identified a curcumin analog that was able to reduce cellular viability of several colorectal cancer cell lines, by modulating stemness traits and inducing apoptosis. Importantly, this compound significantly reduced tumor burden in an in vivo xenograft mouse model following the same mechanisms of action. Moreover, in silico analysis identified nuclear factor kappa B (NF-ĸB) and STAT3 as putative molecular targets that were later confirmed both in vitro and in vivo. In conclusion, our studies highlight how hormones associated with obesity may pose as biomarkers in chronic disease diagnosis and valuable tools in cancer prognosis. Moreover, our results support the influence of obesity on cancer development and clinical outcome, and how its associated signaling pathways provide valuable targets for an innovative approach developed to treat cancer. Finally, we discovered a novel molecule that by targeting those signaling pathways could be a promising drug candidate for therapy insensitive tumors.

2022-09Doctoral thesis

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Unveilling the interplay between activated astrocytes and neurons in an in vitro model of alzheimer’s disease

Publication . Moreira, Ana Filipa da Costa; Brites, Dora Maria Tuna de Oliveira; Borralho, Adelaide Maria Afonso Fernandes

Nas últimas décadas, o aumento demográfico da população com 65 ou mais anos tem vindo a traduzir-se num aumento da prevalência de doenças associadas à idade. Atualmente, a Doença de Alzheimer (DA) representa um dos maiores problemas de saúde do século XXI, sendo considerada a forma mais comum de demência (60-80%) entre esta população. De acordo com dados recentes, mais de 50 milhões de indivíduos à escala mundial são afetados por esta patologia, estimando-se uma duplicação deste valor a cada 20 anos. Perante um crescimento tão acelerado, em 2050 prevê-se que um total de 131.5 milhões de casos seja atingido, sendo esperado o diagnóstico de um novo caso a cada 3.2 segundos. De facto, com números tão dramáticos, a procura de um diagnóstico preciso e tratamento eficaz na prevenção da doença, ou pelo menos da sua progressão, assume um carácter de urgência a nível da intervenção em saúde e tornou-se uma prioridade no combate a esta patologia, dado o seu elevado impacto socio-económico. Até à presente data, apenas quatro agentes terapêuticos para a DA mereceram a aprovação da Agência Europeia do Medicamento. No entanto, apesar de atrasarem a progressão do declínio cognitivo associado à mesma, nenhum destes fármacos apresenta a capacidade de travar o processo neurodegenerativo de um modo eficiente, evidenciando a necessidade de desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Em termos patofisiológicos, a DA é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela deposição extracelular do péptido β-amilóide e acumulação intraneuronal de emaranhados neurofibrilares, que resultam numa massiva perda de neurónios e dos contactos sinápticos, envolvidos na formação de memória e no desenvolvimento de capacidades cognitivas. Para além destas características, a neuroinflamação surge também como uma importante componente patológica que contribui para a progressão e exacerbação da doença, justificando possivelmente a heterogeneidade clínica observada entre os diferentes doentes. Apesar do seu evidente envolvimento nesta patologia ainda não é, no entanto, totalmente compreendido se a neuroinflamação surge como causa ou consequência da neurodegeneração, não sendo pois claros quais os mecanismos envolvidos neste processo. Na DA, a reação inflamatória ocorre nas regiões cerebrais afetadas pela doença e é atribuída maioritariamente às células imunitárias residentes no Sistema Nervoso Central (SNC), nomeadamente a microglia e as células mielóides perivasculares. As células microgliais são consideradas os macrófagos residentes do cérebro, apresentando-se em condições fisiológicas num estado de vigilância designado por M0, à luz do referido para os macrófagos. Perante alterações da homeostase do SNC, as células microgliais tornam-se ativadas, podendo adquirir o perfil M1 pro-inflamatório, que está geralmente associado à libertação de mediadores promotores do processo de inflamação. Apesar de as células da microglia serem consideradas as principais mediadoras desta resposta neuroinflamatória, sabe-se também que os astrócitos desempenham funções igualmente importantes como mediadores da neuroinflamação. Tal como a microglia, os astrócitos têm a capacidade de responder a diferentes tipos de estímulos que podem ocorrer no SNC e afetar o seu normal funcionamento. Geralmente, esta capacidade de resposta é acompanhada por algumas alterações nas próprias células, quer na sua morfologia, quer em aspetos relativos aos processos de transcrição, que acabam por influenciar a sua funcionalidade. Para além disso, os astrócitos, tal como outras células, têm a capacidade de libertar vesículas extracelulares (VEs) como forma de comunicação intercelular. Num contexto neuroinflamatório, as células astrogliais podem secretar pequenas VEs (pEVs) contendo microRNAs (miRNAs) capazes de modular a resposta inflamatória por parte de outras células e também afetar as suas funções. Apesar destas evidências, a população astroglial permanece ainda pouco investigada, sendo necessário um maior número de estudos para esclarecer quais os mecanismos envolvidos na resposta inflamatória mediada pelos astrócitos e de que forma a neuroinflamação de facto contribui para a neurodegeneração presente na DA. Recentemente foi descrito que, quando incubados com fatores solúveis (TNF-α, IL-1β e C1q) derivados da microglia ativada em estado M1 pro-inflamatório, os astrócitos são capazes de adquirir um fenótipo de ativação A1, com propriedades neurotóxicas cruciais para a progressão da patologia. Apesar de ter sido mostrado que os astrócitos A1 representam uma grande proporção de astrócitos na DA, ainda não é claro quais os mecanismos envolvidos na neurotoxicidade provocada por este tipo de células, principalmente devido à escassez de plataformas biológicas experimentais eficientes no estudo da função glial no contexto da doença. Neste trabalho usámos a linha celular glial fetal 10B1 e as células neuronais humanas SH-SY5Y (SH) transfetadas com a mutação Swedish APP695 (SHSwe), de modo a avaliar o seguinte: 1.As alterações no fenótipo dos astrócitos 10B1 após ativação em A1 (10B1A1) relativas à morfologia celular, expressão de mediadores inflamatórios, bem como de miRNAs comumente associados à neuroinflamação, quer nas células, quer nas pVEs; 2. Os efeitos causados pela co-cultura das células 10B1A1/SHSwe no fenótipo dos astrócitos, nomeadamente no seu perfil inflamatório, bem como dos mesmos miRNAs nos astrócitos activados e suas pVEs; e 3. O impacto provocado pela co-cultura 10B1A1/SHSwe na disfunção neuronal, nomeadamente no comprimento das neurites, seu perfil inflamatório, bem como a expressão de miRNAs nas células e pVEs. A ativação A1 nos astrócitos 10B1 levou a um aumento da expressão de GFAP e hipertrofia às 24 h de incubação. Para além disso, observou-se ainda uma elevada expressão inicial dos genes TNF-α e IL-10 (4 h), tal como dos miRNA-155, miRNA-146a e miRNA-124. A ativação A1, diminuiu ainda a expressão do miRNA-124 nas pVEs derivadas dos astrócitos 10B1A1, indicando a sua acumulação a nível celular. A seguir, analisou-se de que forma esse fenótipo era positivamente ou negativamente regulado pela presença dos neurónios SHSwe relativamente às células SH não mutadas. Não se verificaram alterações na viabilidade dos astrócitos, mas as células adquiriram uma morfologia mais arredondada, diminuindo o número de células com aparência de fibroblastos, quando incubadas na presença dos neurónios SHSwe. Também demonstraram uma tendência para aumentar a expressão génica de TNF-α e foram capazes de reduzir marcadamente a expressão génica de IL-10, menos nas células expostas aos neurónios mutados, se comparadas com os astrócitos incubados em monocultura. Quando aferidos à co cultura com SH, os astrócitos 10B1A1 expostos aos neurónios SHSwe apresentaram um aumento de expressão do gene da IL-10, bem como de miRNA -155, miRNA-146a e miRNA-125b. Semelhante ao observado com a ativação nos astrócitos, observámos agora uma retenção intracelular de miRNA-155, que levou à sua diminuição nas pVEs comparativamente ao observado nas pVEs das co-culturas com SH. Passando agora para o efeito que os astrócitos ativados podem causar nos neurónios SHSwe, detetámos uma redução do comprimento das suas neurites, a qual não foi observada nas coculturas com os neurónios não mutados. Para além disso, os astrócitos 10B1A1 não alteraram a expressão do gene da IL-10 nas células SHSwe, mas aumentaram os níveis do gene da TNF-α de uma forma marcada quando os resultados foram comparados aos obtidos nas coculturas com os neurónios SH. Nestas, curiosamente, a exposição aos astrócitos 10B1A1 até diminuiu tal expressão. Verificámos ainda que os astrócitos activados são capazes de elevar a expressão de miRNA-155, miRNA-146a, miRNA-124, miRNA-125b e miRNA-21, causando uma marcada desregulação, também mantida nas células mutadas, mas não atingindo significância estatística em resultado de menor reprodutibilidade experimental no trabalho com as células SHSwe. O facto de, até ao momento, ainda não existirem terapias eficazes no tratamento da DA deve se, em parte, à utilização de modelos experimentais que não recapitulam na sua plenitude os mecanismos patológicos que caracterizam a doença no ser humano. A grande maioria dos modelos utilizados para explorar o papel dos astrócitos na DA são baseados em modelos animais. No entanto, apesar das suas vantagens, estes modelos apresentam alguns problemas derivados das diferenças específicas entre espécies, o que reforça a necessidade de modelos mais representativos e aproximados à biologia humana que permitam abordar estratégias terapêuticas mais adequadas e eficazes. Concluindo, o nosso modelo in vitro da DA, usando co-cultura de células humanas, reflete algumas das características observadas na doença e fornece um novo conhecimento sobre o papel dos astrócitos ativados em A1 nos processos neuroinflamatórios e neurodegenerativos que ocorrem na patologia, apresentando uma boa oportunidade para explorar de uma forma mais aprofundada o modo como a comunicação neurónios-glia está envolvida na doença.

2019-02-25Master thesis

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Design and Characterization of a New Quercus Suber-Based Pickering Emulsion for Topical Application

Publication . Carriço, Catarina; Pinto, Pedro; Graça, Angélica; Gonçalves, Lídia; Ribeiro, Helena; Marto, Joana

Quercus Suber Bark from Quercus suber L. is a natural, renewable and biodegradable biomaterial with multifunctional proprieties. In this study, we used it as solid particles to stabilize a Pickering emulsion. The main goal was to produce an optimized topical formulation using biocompatible organic particles as stabilizers of the emulsion instead of the common surfactants, whilst benefiting from Quercus suber L. proprieties. In this work, a Quality by Design (QbD) approach was successfully applied to the production of this emulsion. A screening design was conducted, identifying the critical variables of the formula and process, affecting the critical quality attributes of the emulsion (droplet size distribution). The optimization of the production was made through the establishment of the design space. The stability was also investigated during 30 days, demonstrating that Quercus Suber Bark-stabilized emulsions are stable since the droplet size distribution lowers. In vitro studies were performed to assess antioxidant and antiaging efficacy, which revealed that the formulation had indeed antioxidant proprieties. A physicochemical characterization demonstrated that the formulation presents a shear-thinning fluid, ideal for topical administration. The in vivo compatibility study confirmed that the final formulation is not skin irritant, being safe for human use. A sensorial analysis was also performed, using a simple sensory questionnaire, revealing very positive results. Thus, the use of Quercus Suber Bark particles as a multifunctional solid ingredient contributed to achieve a stable, effective and innovative Pickering emulsion with a meaningful synergistic protection against oxidative stress.

2019-03Journal article

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A Critical Perspective on 3D Liver Models for Drug Metabolism and Toxicology Studies

Publication . Serras, Ana S.; Rodrigues, Joana S.; Cipriano, Madalena; Rodrigues, Armanda V.; Oliveira, Nuno G; Miranda, Joana P

The poor predictability of human liver toxicity is still causing high attrition rates of drug candidates in the pharmaceutical industry at the non-clinical, clinical, and post-marketing authorization stages. This is in part caused by animal models that fail to predict various human adverse drug reactions (ADRs), resulting in undetected hepatotoxicity at the non-clinical phase of drug development. In an effort to increase the prediction of human hepatotoxicity, different approaches to enhance the physiological relevance of hepatic in vitro systems are being pursued. Three-dimensional (3D) or microfluidic technologies allow to better recapitulate hepatocyte organization and cell-matrix contacts, to include additional cell types, to incorporate fluid flow and to create gradients of oxygen and nutrients, which have led to improved differentiated cell phenotype and functionality. This comprehensive review addresses the drug-induced hepatotoxicity mechanisms and the currently available 3D liver in vitro models, their characteristics, as well as their advantages and limitations for human hepatotoxicity assessment. In addition, since toxic responses are greatly dependent on the culture model, a comparative analysis of the toxicity studies performed using two-dimensional (2D) and 3D in vitro strategies with recognized hepatotoxic compounds, such as paracetamol, diclofenac, and troglitazone is performed, further highlighting the need for harmonization of the respective characterization methods. Finally, taking a step forward, we propose a roadmap for the assessment of drugs hepatotoxicity based on fully characterized fit-for-purpose in vitro models, taking advantage of the best of each model, which will ultimately contribute to more informed decision-making in the drug development and risk assessment fields.

2021-02-22Journal article

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