FM - Teses de Doutoramento
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- Epidemiologia da pressão arterial e da lipidémia em amostras da população portuguesaPublication . Miguel, José M. Pereira, 1947-
- A doença de Alzheimer : problemas do diagnóstico clínicoPublication . Garcia, Carlos Alberto Barata Dias, 1936-2004
- Neurologia do comportamento : estudo de correlacção com a tomografia axial computorizadaPublication . Ferro, JM; Antunes, João Lobo,1944-2016
- Contribuição para o estudo dos efeitos da contracção muscular : modelo experimental - porco anestesiadoPublication . Fresta, Mário, 1957-; Carvalho, Luís da Silva, 1911-
- Implantes de alumina e de zircónio : estudo experimental comparativoPublication . Tavares, António Vasconcelos, 1945-; Pádua, Fernando de, 1927-
- A medicina geral e familiar : caracterização da prática e sua influência no ensino pré-graduadoPublication . Jordão, José Guilherme, 1951-2003; Pereira, Artur Torres, 1924-; Pádua, Fernando de, 1927-Após a criação da disciplina de Clínica Geral e Medicina Comunitária, a Faculdade de Medicina de Lisboa incluiu no seu Plano de Estudos a área da Medicina Geral e Familiar. O presente trabalho " Medicina Geral e Familiar — Caracterização da prática e sua Influência no Ensino Pré-graduado" evidencia uma finalidade dominante, embora com vertentes diversas desse mesmo propósito. Assim, inserido num contexto exploratório e descritivo, pretende contribuir para o processo educativo centrado na Educação Médica pré-graduada, mormente no ensino e na aprendizagem da Medicina Geral e Familiar como área acadêmica. Tendo como referência o perfil funcional do médico de família, caracterizam-se aspectos da sua prática, procurando Identificar necessidades formativas e, eventualmente, estratégias pedagógicas, de modo a que, a disciplina de Clínica Geral e Medicina Comunitária em particular, e a Faculdade de Medicina em geral, possam melhor responder ao desafio de proporcionar aos futuros médicos a aquisição de competências relacionadas com o exercício daquela especialidade, tal como ela hoje é entendida. Assim, este estudo identifica, no essencial, algumas características sócio-demográficas relacionáveis com os estados de saúde e de doença dos utentes que consultam o médico de família, os motivos que expressam e os problemas de saúde que apresentam. Com base nos resultados encontrados, foi obtida a Informação necessária para que o ensino e a aprendizagem, a nível pré-graduado, sejam adequados á procura de cuidados de saúde, estimulem a opção pela área da Medicina Geral e Familiar e promovam a aproximação da "prática real" à "prática Ideal" decorrente do perfil profissional específico do médico de família. A identificação de algumas das vertentes referidas pode ser traduzida em objectivos distintos mas Interrelacionados, expressos na formulação das questões orientadoras do processo da pesquisa: Como pode a prática da Medicina Geral e Familiar contribuir para o Ensino Médico Pré-graduado? Como pode o Ensino Médico Pré- -graduado contribuir para a prática da Medicina Geral e Familiar? Como pode a Disciplina de Clínica Geral contribuir para a prática da Medicina Geral e Familiar? Uma vez definida a finalidade do estudo e determinada a estratégia de cararacterização da prática da Medicina Geral e Familiar na zona sul, área de Influência da Faculdade de Medicina de Lisboa, que abrange as regiões de Lisboa e Vale do Tejo, Alentejo e Algarve, o objectivo do estudo reside em três perguntas fundamentais, cuja formulação condiciona os métodos e a Interpretação dos resultados: Quem consulta o médico de clínica geral? (perfil do utilizador); Porquê? (motivos de consulta); Com quê? (problemas de saúde). Na estrutura do trabalho é abordada a evolução histórica e conceptual da Medicina Geral e Familiar, nomeadamente, no que se refere à designação adoptada, aos princípios da disciplina académica e da prática, ao perfil do médico de família e, ao seu papel e contexto de exercício profissional. Na parte introdutória são ainda referidas as situações portuguesa e mundial, bem como as tendências evolutivas da prática da especialidade. De igual modo é considerada a relação da Educação Médica com o desenvolvimento da Medicina Geral e Familiar, com destaque para o Ensino Pré-graduado em geral e, em particular, com a área de intervenção do médico de família. Assim, o contexto do estudo parte do perfil daquele profissional para a prática e, com base nesta, procura obter informação pertinente ao respectivo ensino e aprendizagem. Contudo, a caracterização referida não pode abordar todas as competências que decorrem do perfil considerado, tendo apenas, como grande objectivo, na área geográfica escolhida, a observação das consultas dos médicos de família, visando os dados relacionados com as respostas às questões acima enunciadas. Como aspectos essenciais da fundamentação do estudo, salitentam- -se o facto de a saúde ser, cada vez mais, compreendida como o resultado de factores múltiplos que devem ser estudados numa perspectiva biopsicossocial, bem como a escassez de trabalhos abrangentes que caracterizem a prática da Medicina Geral e Familiar. Deste modo, foram identificadas como variáveis a estudar, as conhecidas pela sua relação com a saúde e a doença nos indivíduos, nas famílias e nas comunidades e, com especial importância na compreensão epidemiológica da morbilidade observada pelos médicos de família. Estão neste caso, relativamente aos utentes,a idade e o sexo, o nível de escolaridade, a situação profissional, o estado civil, o tipo de família, a funcionalidade familiar e as condições gerais de habitação, para além do local de consulta, dos motivos que a justificam e dos problemas de saúde e diagnósticos encontrados. Outro aspecto do estudo, que a literatura nacional e Internacional consultada não contempla, é a caracterização da prática nos diferentes contextos sócio-demográficos, nomeadamente, nos tipos urbanos (grande cidade, em meio rural e em meio industrial) e no tipo rural. A população alvo corresponde a uma população presente de 4.070.317 habitantes (Censo de 1991) e a estatística ou amostrada é definida como a população consumidora dos cuidados prestados nos 141 centros de saúde da Zona Sul. Esta população é um subconjunto da inscrita nas listas dos 2.471 médicos de família que exercem nesses centros e que, por seu turno, representa uma fracção da sua população dependente. A amostra dos centros de saúde foi obtida por estratificação de base populacional, tendo os inquiridores sido seleccionados de modo não aleatório. No inquérito que serviu de apoio ao estudo, o número de variáveis e das respectivas modalidades consideradas ultrapassa 1300, tendo em conta a Classificação Internacional em Cuidados Primários (ICPC) adoptada para a codificação dos motivos de consulta e dos problemas de saúde. Este facto, a duração da recolha de dados, o tipo de amostragem (por estratificação) e as inevitáveis perdas por incumprimento do processo metodológico, aconselharam a fixar arbitrariamente, por excesso, o valor de 20.000 observações na constituição da amostra. No termo da recolha de dados, o respectivo tratamento exigiu a sua classificação e codificação para posterior tratamento informático. Em termos gerais, depois das 48 semanas de duração do estudo e do trabalho dos 65 médicos inquiridores nos 63 centros de saúde escolhidos aleatoriamente, foram obtidos os seguintes resultados: 18.805 utentes observados, 6.953 do sexo masculino (37%) e 11.852 do sexo feminino (63%); 1900 crianças dos dois sexos (10%); 18.341 consultas no centro de saúde e 464 no domicílio; 29.896 motivos de consulta registados (1,6 por utente); 48.678 problema? de saúde em 17.126 utentes (2,8 por utente); 1.679 utentes sem problemas registados. Da informação obtida com os dados das variáveis sócio- -demográficas e da estratégia metodológica seguida, salienta-se a determinação de três grupos de utentes com características próprias que se integram em "retratos-tipo" que os Identificam: O da criança, que abrange a quase totalidade dos utentes de ambos os sexos até aos 15 anos de idade, engloba crianças em fase pré-escolar ou com escolaridade não aplicável, se menores de 5 anos e, nas restantes, com um nível de escolaridade não discriminante. Todas elas, em cerca de 60 % dos casos, vivem em famílias nucleares e supostamente funcionais e, em condições salubres, sublinhando-se que, pela não descriminação das características individuais, é o contexto familiar que condiciona o retrato; O do adulto masculino, que abrange mais de metade destes utentes, identifica os utilizadores Jovens e de meia idade, casados e trabalhadores activos, bem como os reformados quando com idade mais avançada. Todos estes adultos são membros de famílias nucleares e supostamente funcionais, vivendo em condições de salubridade; O do adulto feminino, que abrange cerca de metade destas utentes, identifica as utilizadoras Jovens e de meia idade, casadas, trabalhadoras activas ou domésticas e, ainda, as mulheres com mais de 65 anos. casadas ou viúvas, reformadas ou domésticas. Todas estas mulheres são membros de famílias nucleares ou alargadas, supostamente funcionais, vivendo em condições de salubridade. Com base nalguns aspectos sócio-demográficos da população estudada, pode afirmar-se a universalidade da intervenção do médico de família que ao observar utentes de todas as idades, de ambos os sexos e de escolaridade, estado civil e situação profissional diferentes, pertencentes a famílias com tipologia e funcionalidade variadas e vivendo em contextos de salubridade distintos, o obriga à valorização da abordagem biopsicossocial. No que se refere aos motivos de consulta, a respectiva discussão decorre dos resultados registados, da classificação adoptada e da sua importância para a compreensão das razões da procura. Aqueles, em termos gerais, foram caracterizados pelas suas distribuições absolutas e relativas, nomeadamente pelas médias de motivos apresentados por utente, sexo, tipo de centro de saúde e agrupamentos etários. A distribuição de motivos pelos capítulos da ICPC permite a determinação dum padrão geral "KALRD", que os relaciona, em termos de frequência, com motivos do aparelho circulatório, gerais e Inespecíficos. do sistema musculo-esquelético e com os dos aparelhos respiratório e digestivo. O tratamento dos 20 primeiros motivos de consulta (48% de todos eles) foi particularmente considerado nas várias partições, com destaque nos três agrupamentos etários considerados, onde cada um deles apresenta um padrão próprio, diferente do geral. A análise dos motivos de consulta permite, em termos pedagógicos, valorizar: a existência de mais dum motivo por consulta em cerca de metade da população; a elevada representação das queixas gerais e inespecíficas e dos pedidos de medicação: a relevância da vigilância de saúde como motivo de consulta; a identificação de padrões de motivos muito abrangentes na população estudada; a importância da informação contida nos registos médicos; a abordagem das razões da procura de cuidados de saúde, no ensino e na aprendizagem do raciocínio médico e da decisão clínica. No que se refere aos problemas de saúde a estratégia seguida é semelhante â utilizada nos motivos. Também, pela distribuição por capítulos da ICPC, é identificado o padrão geral "KLDPTR" que os relaciona, em termos de frequência, com problemas do aparelho circulatório, do sistema musculo-esquelético, do aparelho digestivo, da área psicológica, do sistema endócrino. metabólico e nutricional e, por fim com os do aparelho respiratório. Os 20 primeiros problemas de saúde que correspondem a 49% de todos eles, são objecto dum tratamento idêntico ao dos motivos e, também, cada um dos agrupamentos etários considerados apresenta o seu próprio padrão. As necessidades formativas e as estratégias pedagógicas decorrentes da análise dos problemas de saúde resultam, fundamentalmente, do seguinte: da frequência da presença simultânea de vários problemas de saúde: da existência de cerca de 80% de problemas relacionados apenas com seis áreas de ensino (padrão geral); dos resultados relativos às doenças não transmissíveis (hipertensão arterial, diabetes, alterações lipídicas, obesidade, osteoartroses, ansiedade, depressão e dependências); a frequência de outros problemas de saúde (asma, amigdalites, doenças pépticas, acidentes vasculares cerebrais e infecções urinárias); da diminuta expressão de certos registos (cárie dentária, tabagismo, consumo imoderado de álcool, hábitos alimentares incorrectos, sedentarismo, stress e risco familiar); da identificação de padrões de problemas multo abrangentes na população estudada. No termo do estudo verifica-se que o método seguido permitiu caracterizar "quem" consulta o médico de família, "porquê" e "com quê", as perguntas que nortearam o presente estudo e, relativamente ãs quais, se podem concretizar as respectivas conclusões. Relativamente â contribuição da prática da Medicina Geral e Familiar para o Ensino Pré-graduado conclui-se pela importância: da formação médica fora dos tradicionais locais de ensino; dos conteúdos das cadeiras e das disciplinas existentes; dos objectivos educacionais pertinentes nas áreas de ensino relacionadas com os padrões de motivos e de problemas; dos aspectos preventivos e de vigilância de saúde; da valorização pedagógica das queixas gerais e inespecíficas, prescrição, multipatologia e certificação de estados de saúde; da relação médico-doente, continuidade de cuidados, custo- -benefício da intervenção médica, sistemas de informação e das características individuais, familiares e socio-económicas dos utentes; dos método de ensino e aprendizagem decorrentes dos cenários de desempenho médico e da resolução de problemas; enfim, da perspectiva integradora que deve orientar o ensino pré-graduado. No que se refere á contribuição do Ensino Pré-graduado para a prática da Medicina Geral e Familiar, conclui-se pela Importância: dos objectivos educacionais relacionados com as Características dos utentes, com os motivos de consulta e com os problemas de saúde; da aplicação de critérios de pertinência na definição desses objectivos; da abordagem sistémica e não apenas biomédica; da aquisição de competências gerais em Ciências Sociais e do Comportamento, e em Investigação, Gestão, Economia e Informação; da transmissão de normas e de valores que enformem a atitude e o comportamento médicos; e por fim, da motivação pela escolha da área dos Cuidados de Saúde Primários. No que respeita à contribuição da Disciplina de Clínica Geral para a prática da Medicina Geral e Familiar, conclui-se pela importância: dos conteúdos da disciplina que valorizem as atitudes e os comportamentos integradores, necessários à prática qualificada do médico de família; dos relacionados com a comunicação, a relação médico-doente, a organização dos cuidados e com os factores sociais e legais ligados â prática; da compreensão das expectativas dos Cidadãos face aos serviços médicos; da responsabilidade do médico de família como agente do primeiro contacto entre o utente e o sistema de saúde e como gestor de recursos; das competências clínicas de diagnóstico, tratamento e seguimento das doenças comuns; das relacionadas com a prevenção da doença em grupos com especiais necessidades de cuidados de saúde; dos diferentes cenários de aprendizagem na preparação dos futuros médicos para a prática na comunidade; e ainda da Interdisciplinaridade e da coordenação Interdepartamental. Finalmente, o estudo realizado permite afirmar que a prática real do médico de família na zona sul de Portugal se inclui na definição do seu perfil funcional e que a aproximação do actual desempenho à prática ideal será facilitada pela intervenção das Faculdades de Medicina, não só na pré-graduação mas, também, pela actuação de departamentos de Medicina Geral e Familiar, na investigação e na formação pós-graduada.
- Cancer : metabolic dysfunction, nutrition and quality of lifePublication . Ravasco, Paula; Camilo, Maria Ermelinda, 1943-Cancer is a major cause of morbidity and mortality worldwide. Cancer is the second most frequent cause of death and is becoming the leading cause of death in an ageing population, as most cancers occur in older adults; of note, cancer-related malnutrition is the immediate cause of death of 20% of the patients with cancer. Notwithstanding that different cancer types or locations may display different nutritional patterns, there is some inconsistency between studies in what concerns nutritional status assessment and cancer/treatment-related variables. A thorough analysis of their interaction is long due, in order to step forward the eagerly awaited evidence to foster the integration of appropriate nutritional therapy. Moreover, although 8 to 84% of cancer patients may present some degree of nutritional deterioration, which has been associated with functional impairment, the interaction between nutritional status and intake, symptoms and other disease/treatment-related factors, is a complex combination which may dictate patients’ Quality of Life (QoL). Nevertheless, the multitude of interactions between cancer location and stage, treatments, nutritional status and intervention, morbidity and QoL has never been thoroughly explored. The evidence for these interactions will be demonstrated in this thesis, which results from the collision of data from several prospective studies conducted in cancer patients. The present Thesis is structured into five sections. 1. Section 1 comprises Chapter 1 and Chapter 2. Chapter 1 describes the aims and the outline of the thesis. Chapter 2 consists of a general introduction reviewing the main concepts relevant to the studies’ design and analyses undertaken in the work ascribed to this thesis; specifically the multifactorial nature of cancer-related malnutrition, its impacts on the patients’ disease progress as well as the interactions between nutrition, morbidity and Quality of Life. 2. In Section 2, a pilot study conducted in a heterogeneous cancer patient population referred for radiotherapy is presented, which includes a critical analysis of different methods to measure QoL and the effect of nutritional intervention on nutritional parameters and QoL: • Chapter 3. Patients submitted to radiotherapy (RT), particularly of the head and neck or the gastrointestinal tract, are at higher risk of malnutrition, aggravated by the therapy induced toxicity that may further compromise nutrition and functional status. Since patients’ QoL reflects functional status, psychosocial well being, health perceptions and disease/treatment-related symptoms, the patients’ nutritional status, nutritional intake and symptoms are thus likely to assume a significant role in their QoL. We investigated: 1) the patients’ nutritional status, nutrient intake and QoL at the onset and at the end of RT, 2) whether individualised nutritional counselling, despite RT-induced symptoms, was able to enhance nutrient intake over time and whether the latter influenced the patient’s QoL and 3) which symptoms may have anticipated poorer QoL and/or reduced nutritional intake. This study showed that in patients prone to develop nutritional problems and to report the worst QoL during RT, an individualised nutritional counselling did improve nutritional intake which was identified as central to a better QoL. Additionally, from the two QoL instruments tested, the non-specific EUROQOL should be used routinely because its completion is less time consuming; the more comprehensive cancer-specific EORTC QLQ C-30 instrument covers more items and scales, identifies more domains and specific complaints, and although time consuming provides the accuracy required for research. Both instruments were able to assess patients’ QoL and both revealed the relevance of nutrition care. 3. Section 3. • Chapter 4. Based on this background, gathering validated objective data on nutritional status and its evolution throughout the disease course is of prime concern. Thus, we conducted a prospective study in head and neck, oesophageal, stomach and colorectal cancer patients, aiming to explore the intricate construct of various disease-related and diet-related factors potentially implicated in the patients’ nutritional deterioration. The disease extent was hypothesized as key to current nutritional status, which was assessed by three different methods, further compared in order to disclose their reliability. Regardless of the nutritional assessment method used, nutritional depletion was a multifactorial outcome determined by cancer and diet-related factors, all of which were simultaneously evaluated in a general linear model. Advanced cancer stage showed by far the most significant association with worse nutritional status; cancer locations, duration of the disease, protein and energy intake, and previous surgery or chemotherapy, were also significantly associated. Besides the identification of valid nutrition assessment tools, this study provided novel clinical evidence of the complex interactions between cancer and/or treatment-related variables and diet modifications, all of which exerted a combined effect on the patients’ nutritional deterioration. Cancer location was the dominant factor influencing the pattern and/or progression of nutritional deterioration; though the tumour burden for the host was of major importance. Our results were consistent with the hypothesized relations between progressive disease and wasting, which purportedly exacerbate every organ/systemic physiological derangement. • Chapter 5. It then became necessary to explore the potential interaction(s) between various disease-related and diet-related factors likely to be implicated in the patients’ QoL. A prospective cross-sectional study was thus conducted in head and neck, oesophageal, stomach and colorectal cancer patients; the specific aims were to evaluate patients’ nutritional status, nutrient intake and QoL, taking into account the disease stage and previous therapeutic interventions, to determine the potential inter-relations, and to quantify the relative impact of cancer/treatments and/or nutrition-related factors on patients’ QoL. This study provided objective evidence that cancer, diet deficits, nutritional deterioration and therapeutic interventions are determinants of the patients’ QoL, but with distinct relative weights. Whilst chemotherapy and surgery were perceived by the patients as of minor relevance, nutritional deficits and/or deterioration were intrinsic to the cancer location and stage, to reduced energy/protein intake and to weight loss, which were independent determinants of QoL. These results concur with seminal landmark data which revealed that semi-starvation impairs functional and psychological abilities, and in addition corroborated our previous study demonstrating the relationship between progressive disease and wasting. 4. Section 4. Based on the knowledge that in the above mentioned cancer patients, the location and stage of the disease as well as nutritional aspects are major determinants of patients’ QoL, it remained to be proven whether nutritional intervention might influence outcomes; therefore two prospective randomised controlled trials of nutritional therapy were conducted: 1) in colorectal cancer or 2) head and neck cancer outpatients, in order to address the potential role of adjuvant oral nutritional support on patients’ outcomes. • Chapter 6. The study herewith summarised was designed to test the hypothesis of a causal pathway between nutritional therapy and functional/clinical outcomes. A prospective randomised controlled trial, in colorectal cancer patients referred for radiotherapy, was designed to investigate whether, and to what degree, total oral intake was affected by dietary counselling or ad libitum intake supplemented with commercial supplements, both provided during RT. Furthermore the impact of nutritional intake on predefined outcomes, nutritional status and QoL, during treatment and 3 months later was examined. Despite the expected and experienced detrimental effects of RT, concurrent nutrition care integrated in the overall patient management allowed proper assessment of nutritional status and nutritional requirements, dietary counselling, education and monitoring of diet compliance and timely management of symptoms. Nutrition intervention was central to the improvement of colorectal cancer patients’ nutritional as well as non-nutritional outcomes: nutritional intake and status, QoL and lessened morbidity even in the medium term. Adding oral nutritional supplements to the diet did not appear to be as effective as dietary counselling. The control group showed a progressive deterioration in all items. • Chapter 7. Within a similar framework, with the same goals and an identical study design as in Chapter 6, the results of a prospective randomised controlled trial of nutritional therapy in head and neck cancer patients, referred for radiotherapy, are presented. The results were similar to those registered in colorectal cancer patients: nutritional counselling was indeed central to the improvement of a diversity of patient outcomes in such patients: nutritional intake, nutritional status, QoL and lessened morbidity, even in the medium term, after treatment completion. Adding oral nutritional supplements to the diet did not appear to be as effective as dietary counselling. Indeed, concurrent individualized dietary counselling based on regular foods, was the most effective means of improving patients’ nutritional intake, status and QoL during RT which are sustained 3 months after its completion, thereby lessening RT induced morbidity. The control group showed a progressive deterioration in all items. 5. Finally, Section 5 comprises Chapter 8 in which results of the studies ascribed to this thesis are discussed and some guidelines for potential future research are also suggested.
- Efeitos cardiopulmonares da simpaticectomia torácica videoassistida na tratamento da hiperhidrose palmar e axilarPublication . Cruz, Jorge Manuel Costa da, 1953-; Almeida, A. Bugalho de, 1942-; Antunes, João Lobo, 1944-
- Pabpn1 protein : aggregation properties in an opmd cellular model and a novel role in splicingPublication . JP; Fonseca, M. Carmo, 1959-Eukaryotic gene expression is a complex stepwise process that begins with transcription initiation and terminates with the synthesis of a specific protein. Before being transported out of the nucleus as mRNAs, primary gene transcripts undergo a series of co- and post-transcriptional maturation events. During transcription, the nascent transcript is capped in its 5´ end, introns are spliced and the 3´end is cleaved and polyadenylated. The mature mRNA is then released from the site of transcription and exported to the cytoplasm for translation. Although these transcriptional maturation processes tend to be studied in a rather simplistic isolated manner, ample evidence exists demonstrating that the various events that constitute pre-mRNA maturation occur in an integrated fashion. Distinct machines carry out each of the steps in the gene expression pathway but despite the unique reactions they catalyse, each machine also interfaces both physically and functionally with other machines in the pathway. More specifically, a wide number of studies have highlighted the role of the Carboxyl Terminal Domain of the largest subunit of RNA Polymerase II as the key determinant player in the coupling of the pre-mRNA maturation events. In this work we have addressed the question of the co-ordination of all the steps of pre-mRNA processing using the poly(A) binding protein nuclear 1 (PABPN1) as a tool. PABPN1 is an abundant nuclear protein that stimulates poly(A) polymerase (PAP) during polyadenylation of mRNA precursors in metazoan cells. PABPN1 acts primarily as a stimulatory factor for the extension of the poly(A) tail and remains associated to the mRNA after the poly(A) addition, travelling with the mRNA to the cytoplasm where translation occurs. In addition to the very well characterized role in stimulating PAP, there are some other reports of additional PABPN1 functions. For instance, PABPN1 has been found in the nuclear nonsense-mediated decay complex, which is thought to complete a "pioneer" round of translation checking the integrity of the mRNA. PABPN1 has also been shown to associate with RNA Polymerase II along the chromatin axis and has been proposed to participate in transcription by associating with the Ski-interacting pre-spliceosomes, thus likely to be recruited protein and with MyoD. It has also been identified as a component of the spliceosome, neither stably associated with U4/U6.U5 tri-snRNPs nor present in purified to the spliceosome at a later, more active, stage of its assembly. Our results demonstrate that PABPN1 plays an unforeseen role in the splicing reaction. Combining a series of in vitro pulldown and immunoprecipitation assays, PABPN1 is shown to interact directly with very well characterized splicing factors and to be recruited to intronic sequences upon gene transcription activation. PABPN1 is also shown to modulate splice site choices in splicing reporter mini-genes, therefore implicating PABPN1, directly or indirectly, in alternative splicing regulation. In addition to its novel role in splicing, we also tried to understand the role of PABPN1 in a human genetic disease called Oculopharyngeal Muscular Dystrophy (OPMD). In 1998, it was found that mutations on the PABPN1 gene were responsible for OPMD. The mutation consists of short (GCG) expansions that result in the expansion of a polyalanine stretch at the N-terminus of the protein. Following the initial methionine, the wild type PABPN1 protein contains a naturally occurring trinucleotide repeat (GCG)6 coding for the first 6 alanines in a 10 tandem alanine stretch. In the OPMD patients, the (GCG)6 repeat is expanded to (GCG)8-13, thus leading to an expansion of the polyalanine tract from 10 to 12-17 alanines in the N-terminus of PABPN1. Because intranuclear inclusions containing PABPN1 represent a pathological hallmark of muscle cells from OPMD patients, it has been suggested that the mutated PABPN1 induces or facilitates the formation of the inclusions. To investigate whether this was the case, we have generated green fluorescent protein (GFP) fusions with PABPN1 variants. These fusion proteins were transiently expressed in human HeLa cells and in the murine myogenic cell line C2. We showed that, upon over-expression, PABPN1 aggregation can occur in the absence of polyalanine expansion. We further demonstrated that propensity of PABPN1 to form intranuclear inclusions is coupled to stimulation of polyadenylation, and protein aggregation is a highly dynamic, reversible process. Our results contributed greatly for the interpretation of OPMD model systems based on exogenous expression of PABPN1.
- The role of hes genes in the controlled production of neuronsPublication . Fior, Rita; Henrique, Domingos, 1960-Cell–cell signalling mediated by the Notch pathway is essential for the spatial and temporal coordination of cellular behaviour in a variety of processes, from embryonic development and stem cell biology to disease. At the core of the Notch signalling pathway are the transmembrane Notch receptors and their ligands from the DSL ( D e lta– S e rrate– L a g-2) family. Upon ligand–receptor interaction, two proteolytic cleavages occur, releasing the N o tch i n tra- c e llular d o main (NICD). The NICD contains nuclear localization signals that render it to the nucleus where it associates with the DNA–binding protein CSL (mamalian C B F-1, Drosophila S u pressor of Hairless, C. elegans L a g-1) to activate expression of its target genes (Kopan, 2002). Notch signalling regulates neurogenesis in animals as different as flies and mammals. Notch signalling acts through a process known as Lateral Inhibition to balance the antagonistic activities of two different sets of bHLH proteins: the proneural proteins that play a positive role, promoting the commitment to a neural fate, and HES proteins that repress this cell fate decision. Cells that express Delta can activate the Notch receptor in neighbouring cells and this leads to transcriptional up–regulation of genes encoding HES proteins, which suppress the activity of the proneural genes and, thereby, keep these cells undifferentiated. In this way, the cell that expresses the ligand Delta realizes its neural potential, becoming a neuron, but simultaneously ensures that the neighboring cells are prevented from doing so. By restraining differentiation, Notch signalling not only ensures the maintenance of a progenitor population but enables cells to be exposed to the various environmental cues that are continuously changing over time, thus, allowing the production of the different types of neurons during the whole embryonic development. The aim of this work is to understand the molecular events downstream of Notch signalling used to control the production of neurons during vertebrate embryonic development. I have concentrated on the hes genes, which are the best characterized Notch targets and effectors. However, many questions remain regarding their general regulation and function. In this work, I describe four novel chick hes genes that are expressed in the developing nervous system: three hes5-like genes (hes5-1, hes5-2 and hes5-3) and one hes6-like (hes6-2). All four genes are expressed in the ventricular zone of the embryonic neuroepithelium, where neural progenitors are located and where the Notch1 receptor is expressed. I show that Notch signalling positively regulates the hes5 genes but reduces expression of hes6-2. Overexpression of HES5 proteins, like the constitutive activation of Notch signalling, leads to inhibition of neurogenesis, implying that hes5 genes are bonafide Notch effectors. Furthermore, this work unravelled a novel circuitry of auto- and cross- regulation between hes genes: each hes5 gene is able to repress hes6-2, and all three hes5 genes seem to be repressed by hes6-2. Moreover, hes5-1 and hes5-2 genes are subjected to negatively auto–regulation. This work proposes that the function of the HES5/HES6 circuitry is a conserved feature of the Notch pathway, modulating the response of neuroepithelial cells to Notch signals at different phases of their development. Neuronal progenitors seem to go through successive Notch activation events until they finally differentiate. In this work, I propose a model in which the HES5/HES6 circuitry of negative auto- and cross-regulation contributes to shut down the pathway after each event of Notch activation. This would enable the progenitors to go back to a “neither–ON–nor–OFF” steady state where they are ready to interact again through lateral inhibition or, in the absence of a Delta inhibitory signal, enter the neuronal differentiation program. In order to test this model and determine if these pulses of Notch activity indeed occur, I developed a real–time imaging system to monitor Notch activity in vivo. A reporter construct composed of the hes5-1 promoter, fused to a destabilized VENUS protein was generated. This reporter recapitulates the endogenous pattern of hes5-1 and responds to Notch signalling, providing a valuable tool to monitor Notch activity in real time. Analysis of time-lapse imaging of neuroepithelial cells containing this reporter revealed a dynamic gene expression pattern suggestive of pulses of Notch activity. The possible functional relevance of these oscillations to control the neurogenesis process is discussed in detail in the general discussion of this work.