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Authors
Abstract(s)
Mammalian early embryo development requires action of a complex network of cell signaling
pathways that coordinates cellular proliferation and differentiation events. Notch is a major
regulator in embryonic and adult scenarios, also interplaying with other signaling pathways,
such as Wnt.
The objective of this work was to determine Notch signaling status in early embryo
development and its influence on cellular differentiation and pluripotency maintenance, and
on embryo competence to implant and develop to term. Additionally, the Notch/Wnt interplay
was investigated in this scenario. Firstly, we analyzed individual embryo transcription of
Notch components and their relation with transcription of pluripotency and differentiation
gene markers (Sox2, Oct4, Klf4, Cdx2). Secondly, a pharmacological approach was used to
induce Notch signaling (recombinant JAGGED1 and 2) and to inhibit Notch and/or Wnt
signaling (DAPT and/or DKK1, respectively). Finally, embryos treated with DAPT and/or
DKK1 were transferred to recipient females and implantation competency (at Day5 of
gestation) and development to term (Day18) were evaluated.
Results showed that transcription of Notch1-2, Jagged1-2 and Hes1 was highly prevalent
and dynamic along stages of development. Transcription of Notch1, Notch2, Jagged2 and
Hes1 correlated with each other and with that of Sox2, Oct4, Klf4 and Cdx2. In vitro embryo
culture supplementation with JAGGED1 had no effect on embryo developmental kinetics,
whereas supplementation with JAGGED2 abolished Jagged1 transcription, downregulated
Cdx2 transcription and inhibited blastocyst hatching. Notch and Wnt had opposing effects on
developmental kinetics, as Notch blockade retarded development and hatching, while Wnt
blockade fastened it. We found evidences of Notch and Wnt interplay in early embryos as
double blockade produced more severe phenotypes than expected by cumulative effects of
single blockades. Notch and double blockade altered trophectoderm cell numbers and inner
cell mass to trophectoderm ratio and all blockades altered transcription of Sox2, Oct4, Klf4
and Cdx2 throughout development. Implantation was unaffected by treatment, but Notch and
double blockades affected the rate of Day18 developed fetuses. Notch blockade produced
lighter and Wnt blockade heavier fetuses.
Overall, results indicate that Notch is active in early embryo development where, together
with Wnt, plays a significant role in controlling the pace of differentiation and proliferation of
the blastocyst, ultimately affecting development to term.
RESUMO - As vias de sinalização Notch e Wnt na regulação do desenvolvimento embrionário precoce - O desenvolvimento embrionário precoce em mamíferos requer a ação coordenada de eventos de proliferação e diferenciação celulares. A correcta coordenação destes eventos está dependente de uma complexa rede de vias de sinalização intercelular. Uma das vias de sinalização intercelular mais conservadas em metazoários é a via Notch. Esta é responsável pela organização da diferenciação celular e manutenção da pluripotência em vários tecidos, quer na embriogénese quer na vida adulta, e interage com outras vias de sinalização, tal como a via Wnt, para este fim. O objetivo deste trabalho foi a determinação da presença e atividade da via Notch no desenvolvimento embrionário precoce em embriões de murganho entre os 3.5 e os 4.5 dias post coitum (dpc). Adicionalmente procurou saber-se quais os elementos da via responsáveis pela transdução de sinal e se a sinalização Notch atua em conjunto com a via Wnt neste cenário. Finalmente procurou estabelecer-se a existência de relações entre os elementos da via Notch e marcadores de estados de pluripotência (Sox2, Oct4, Klf4) e diferenciação (Cdx2) embrionários, assim como a possível influência das vias Notch e Wnt na capacidade de implantação embrionária e no desenvolvimento fetal até termo. A transcrição dos componentes da via Notch (recetores Notch1-4; ligandos Delta-like1 e 4 e Jagged1-2; e efetores Hes1-2) e dos marcadores Sox2, Oct4, Klf4 e Cdx2 foi analisada em embriões individuais e inteiros recorrendo à técnica de PCR em tempo real. De seguida, foi usada uma abordagem farmacológica in vitro para induzir a via Notch com proteínas recombinantes JAGGED1 e JAGGED2, e para inibir as vias Notch e Wnt com DAPT (um inibidor da gama-secretase) e/ou DKK1 (um inibidor competitivo da via), respectivamente. Os embriões foram recolhidos in vivo aos 2.5 dpc e postos em cultura in vitro até aos 4.5 dpc com os respetivos tratamentos. Desta forma foram analisados a cinética de desenvolvimento embrionário dos 3.5 aos 4.5 dpc, a contagem diferencial de células da trofectoderme (TE) e do botão embrionário (ICM), e a transcrição de genes das vias Notch e Wnt e dos marcadores de pluripotência/diferenciação em embriões de 3.5 dpc. Finalmente, blastocistos e blastocistos expandidos tratados com DAPT e/ou DKK1 foram transferidos aos 4.0 dpc para fêmeas recetoras e analisaram-se as taxas de implantação aos 5 dias de gestação e a taxa de desenvolvimento fetal aos 18 dias de gestação, assim como os pesos dos fetos resultantes...
RESUMO - As vias de sinalização Notch e Wnt na regulação do desenvolvimento embrionário precoce - O desenvolvimento embrionário precoce em mamíferos requer a ação coordenada de eventos de proliferação e diferenciação celulares. A correcta coordenação destes eventos está dependente de uma complexa rede de vias de sinalização intercelular. Uma das vias de sinalização intercelular mais conservadas em metazoários é a via Notch. Esta é responsável pela organização da diferenciação celular e manutenção da pluripotência em vários tecidos, quer na embriogénese quer na vida adulta, e interage com outras vias de sinalização, tal como a via Wnt, para este fim. O objetivo deste trabalho foi a determinação da presença e atividade da via Notch no desenvolvimento embrionário precoce em embriões de murganho entre os 3.5 e os 4.5 dias post coitum (dpc). Adicionalmente procurou saber-se quais os elementos da via responsáveis pela transdução de sinal e se a sinalização Notch atua em conjunto com a via Wnt neste cenário. Finalmente procurou estabelecer-se a existência de relações entre os elementos da via Notch e marcadores de estados de pluripotência (Sox2, Oct4, Klf4) e diferenciação (Cdx2) embrionários, assim como a possível influência das vias Notch e Wnt na capacidade de implantação embrionária e no desenvolvimento fetal até termo. A transcrição dos componentes da via Notch (recetores Notch1-4; ligandos Delta-like1 e 4 e Jagged1-2; e efetores Hes1-2) e dos marcadores Sox2, Oct4, Klf4 e Cdx2 foi analisada em embriões individuais e inteiros recorrendo à técnica de PCR em tempo real. De seguida, foi usada uma abordagem farmacológica in vitro para induzir a via Notch com proteínas recombinantes JAGGED1 e JAGGED2, e para inibir as vias Notch e Wnt com DAPT (um inibidor da gama-secretase) e/ou DKK1 (um inibidor competitivo da via), respectivamente. Os embriões foram recolhidos in vivo aos 2.5 dpc e postos em cultura in vitro até aos 4.5 dpc com os respetivos tratamentos. Desta forma foram analisados a cinética de desenvolvimento embrionário dos 3.5 aos 4.5 dpc, a contagem diferencial de células da trofectoderme (TE) e do botão embrionário (ICM), e a transcrição de genes das vias Notch e Wnt e dos marcadores de pluripotência/diferenciação em embriões de 3.5 dpc. Finalmente, blastocistos e blastocistos expandidos tratados com DAPT e/ou DKK1 foram transferidos aos 4.0 dpc para fêmeas recetoras e analisaram-se as taxas de implantação aos 5 dias de gestação e a taxa de desenvolvimento fetal aos 18 dias de gestação, assim como os pesos dos fetos resultantes...
Description
Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, na especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas
Keywords
Notch Wnt embryogeneis pluripotency differentiation Notch Wnt embriogénese pluripotência diferenciação
Pedagogical Context
Citation
Batista MR. 2020. Notch and Wnt signaling interplay on regulation of early embryo development [dissertation]. Lisboa: FMV-Universidade de Lisboa.
Publisher
Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina Veterinária