A carregar...
Publicação
Drug delivery to the brain : design of peptides for selective blood-brain barrier transmigration
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 3.41 MB | Adobe PDF |
Autores
Resumo(s)
A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência, representando cerca de 50% a 75% de todos os casos de demência mundiais. O envelhecimento da população bem como o aumento da esperança media de vida da população tem aumentado exponencialmente a incidência e prevalência mundial desta doença neurodegenerativa. A sintomatologia desta doença é caracterizada por perda de memória, deterioramento de capacidades cognitivas como a aprendizagem, a linguagem, a concentração, entre outras, e ainda dificuldades na atividade motora, afetando a capacidade do paciente viver de forma independente. Ao nível molecular a AD está fortemente associada à presença de placas senis, resultante da acumulação extracelular de péptido Aβ, e à formação intracelular de emaranhados neurofibrilares, compostos por proteína Tau hiperforforilada.
Nas últimas décadas, tem sido feitos inúmeros esforços com o objetivo de identificar estratégias terapêuticas para a AD, contudo cerca de 99% dos ensaios clínicos realizados falham. A grande limitação encontrada pela maioria dos potenciais fármacos para a AD centra-se na sua dificuldade em atravessar a barreira hematoencefálica (BBB).
Os péptidos translocadores de membranas (CPPs) fazem parte de um grupo de péptidos bioativos em membranas. A grande maioria dos CPPs são moléculas positivamente carregadas e anfipáticas que permitem uma distribuição uniforme, segura e eficiente de moléculas terapêuticas para o sistema nervoso central (CNS) sem causar danos significativos na integridade da BBB. Assim, a utilização de tecnologias de distribuição de fármacos mediadas por CPPs vieram revolucionar a distribuição de fármacos para o CNS, revelando-se recentemente importantes no transporte de pequenas moléculas, péptidos, proteínas, anticorpos, nanopartículas entre outras moléculas, quer in vivo como in vitro.
Os vírus são considerados fontes de péptidos multifuncionais, alguns dos quais podem atuar eficientemente como CPPs. Recentemente as proteínas com estrutura em hélice da cápsula do vírus dengue foram experimentalmente testadas com o intuito de obter novos potenciais péptidos translocadores da BBB. O PepH3, obtido da hélice 𝛼3, foi selecionado de um conjunto de 5 péptidos cuja eficácia foi experimentalmente testada num modelo celular in vitro de BBB, construído com linhas celulares endoteliais de cérebro de ratinho (bEnd.3 cells). O mesmo péptido, quando testado num modelo de BBB in vitro, apresentou elevada taxa de transmigração da BBB, após 24 horas de incubação, cerca de 70%. Além do que, em estudos de biodistribuição realizados in vivo com modelo de ratinho, o mesmo péptido apresentou rápida captação para o cérebro (0.31 ± 0.07 %ID/g) ao fim e 5 minutos e também uma rápida eliminação (36.0 ± 11.2 %ID/g) ao fim de 1 hora. O mecanismo de translocação da BBB utilizado pelo PepH3 permanece desconhecido, contudo, e uma vez que as cargas positivas interagem electrostaticamente com as cargas negativas das células endoteliais de cérebro, um mecanismo de transcitose independente da mediação de recetores à superfície das membranas, transcitose adsortiva (AMT), parece ser o mais plausível. Em suma, o PepH3 surge como um promissor veículo de distribuição de moléculas potencialmente terapêuticas para alvos localizados no CNS, devido à capacidade demonstrada de transpor a BBB e regressar novamente para a corrente sanguínea para ser excretado.
O principal objetivo do presente trabalho foi desenvolver péptidos análogos do PepA (acima referido como PepH3) in silico, melhorando a sua capacidade de transmigrar a BBB utilizando um modelo in vitro de células endoteliais de cérebro de ratinho, bEnd.3 ATCC 2299. Em segundo lugar, testou-se a aplicação do PepA como sistema de distribuição de moléculas potencialmente terapêuticas através da sua fusão com um anticorpo de domínio único anti-Aβ (sdAb).
Dezoito péptidos similares ao PepA foram geneticamente combinados com a proteína verde fluorescente (GFP) e, as proteínas recombinantes foram obtidas após expressão em células competentes de Escherichia Coli BL21 (DE3) seguida de purificação utilizando duas técnicas de cromatografia, troca iónica e exclusão molecular. Estas proteínas recombinantes apresentam características bifuncionais uma vez que, podem ser facilmente detetadas por fluorescência, devido à presença da proteína GFP e, por outro lado, incluem o potencial CPP. Das proteínas recombinantes purificadas, onze foram selecionadas ao acaso e a sua capacidade de transmigração foi avaliada utilizando um modelo in vitro de BBB composto por células bEnd.3. A predisposição das proteínas recombinantes selecionadas para atravessar células endoteliais de cérebro foi avaliada por medição de fluorescência resultante da proteína GFP. Foi também avaliada a toxicidade celular de cada uma das proteínas recombinantes, para tal foi medida a fluorescência após 2 horas de incubação do modelo in vitro de BBB com um dextrano fluorescente de 40 kDa de peso molecular (FD40).
De acordo com os resultados obtidos foi confirmada a atividade funcional do PepA como CPP após 5 horas de incubação resultando numa percentagem de captação celular de 34.8% ± 6.4. Quatro péptidos análogos ao PepA apresentaram a mesma capacidade funcional deste; três (PepB, PepC e o PepH) são péptidos positivamente carregados e, um tem carga global negativa (PepNeg). Apenas o péptido carregado negativamente, PepNeg, demonstrou melhoria na capacidade de transmigrar a BBB comparativamente com o PepA, cerca de 44.7% ± 3.5. Além do que, este foi também o péptido que apresentou menor toxicidade celular em comparação com todos os outros péptidos testados. O estudo realizado ao PepA e aos quatro novos CPPs, análogos ao primeiro, revela diferenças nas propriedades físico-químicas, sugerindo mecanismos de internalização distintos.
Neste estudo testou-se ainda a utilização do PepA como sistema de distribuição de um sdAb, assim a percentagem de captação celular da proteína de fusão sdAb_PepA foi determinada através da técnica de Western Blot. A proteína de fusão revelou-se ineficiente a transmigrar a BBB, percentagem de captação celular de <0.1%, o que sugere uma perda de atividade funcional do PepA como CPP possivelmente devido a um rearranjo tridimensional desfavorável quando conjugado com o sdAb. Considerando os resultados anteriormente descritos, foi utilizado o teste da Thioflavina T (ThT) para investigar a influência do PepA na atividade funcional do sdAb, especificamente desenvolvido para reconhecer o péptido Aβ1-42. A ThT ligou-se as fibras amilóides permitindo a quantificação e monitorização da cinética de inibição da formação de agregados de péptido Aβ pela proteína de fusão sdAb_PepA. Em suma, a proteína sdAb_PepA revelou elevado potencial como inibidor da formação de fibras amilóides.
Os resultados obtidos permitem concluir que os quatro novos CPPs, provenientes de mutações realizadas na sequência aminoacídica do PepA, representam novas possibilidades para o tratamento de doenças relacionadas com o CNS. No entanto, contrariamente ao esperado, o PepNeg foi o único péptido com evidente melhoria na transmigração da BBB em comparação com o PepA. Os novos CPPs encontrados têm elevada atividade funcional e um amplo espetro de ação, por conseguinte, o mecanismo de atuação de cada um poderá ser diferente. Considerando os novos CPPs catiónicos obtidos neste estudo, os dados recolhidos para o PepA e estudos realizados anteriormente, um mecanismo de translocação direta deverá ser o utilizados por estes para transmigrar a BBB, por outras palavras, as interações electroestáticas entre a superfície de membrana carregada negativamente com as cargas positivas do péptido são fundamentais para a sua internalização. No entanto, os resultados obtidos com o péptido PepNeg sugerem um mecanismo de translocação independente das interações electroestáticas entre a superfície das membranas celulares e o CPP negativamente carregado.
Por fim, os resultados obtidos para no teste da ThT sugerem que o anticorpo sdAb diminui a acumulação de péptido Aβ in situ, podendo ser potencialmente útil no tratamento da AD quando conjugado com um dos novos CPPs.
Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia in worldwide population, accounting for 50% to 75% of all dementia cases. The first AD-associated symptom is memory loss followed by several intellectual and physical disabilities with impact in patients daily live. The extracellular deposition of Aβ peptide aggregates and the intraneuronal neurofibrillary tangles are neuropathological hallmarks of AD. Despite the efforts of the scientific community in the last decades, this debilitating disease remains without any effective treatment. Cell-penetrating peptides (CPPs) have been developed for therapeutic purposes driven by the need of effective drug delivery technologies to cross the blood-brain barrier (BBB) and reach the central nervous system (CNS). Therefore, this study aims to develop peptides analogues to PepA, a CPP obtained from the sequence of the dengue virus type 2 capsid protein, to improve its ability to translocate mouse brain endothelial cells. The PepA potential as drug delivery system to carry a single-domain antibody against Aβ peptide (sdAb) was also evaluated. Eighteen fusion proteins were genetically engineered, expressed and purified in order to have both properties: fluorescence intensity given by the green fluorescent protein (GFP) and the cell penetration functional ability given by the CPP. Eleven of these fusion proteins were randomly selected and their cell-penetrating predisposition was evaluated, as well as their cellular toxicity through an in vitro bEnd.3 cells model, using GFP and FD40 (FITC-labeled dextran with molecular weight of 40 kDa), respectively. The PepA showed 34.8% ± 6.4 of cellular uptake. In addition to PepA, four new designed peptides revealed to be potential CPPs – three of them are positively charged peptides (PepB, PepC and PepH) and, one (PepNeg) is negatively charged. The PepNeg was the only tested peptide that showed improved ability to translocate BBB (about 44.7% ± 3.5) and lower cellular toxicity, in comparison to PepA. The peptides different physicochemical properties suggests distinct internalization mechanisms between them. Moreover, the cellular uptake of the fusion protein sdAb_PepA was insignificant, probably due to a lack of functional activity of PepA as CPP. After the fusion protein transcytosis low percentage determined using western blot analysis, the functional activity maintenance of sdAb against Aβ1-42 when conjugated to PepA was investigated. Afterwards, the sdAb_PepA revealed high inhibitory amyloidogenic potential when the fibrillation kinetic was monitored by an in situ real-time Thioflavin T assay. In conclusion, four new CPPs were obtained from PepA, highlighting new possibilities for CNS related diseases treatment. Furthermore, the Aβ peptide accumulation decrease caused by sdAb suggests that one of these new CPPs conjugated to sdAb could be potentially useful in the treatment of AD.
Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia in worldwide population, accounting for 50% to 75% of all dementia cases. The first AD-associated symptom is memory loss followed by several intellectual and physical disabilities with impact in patients daily live. The extracellular deposition of Aβ peptide aggregates and the intraneuronal neurofibrillary tangles are neuropathological hallmarks of AD. Despite the efforts of the scientific community in the last decades, this debilitating disease remains without any effective treatment. Cell-penetrating peptides (CPPs) have been developed for therapeutic purposes driven by the need of effective drug delivery technologies to cross the blood-brain barrier (BBB) and reach the central nervous system (CNS). Therefore, this study aims to develop peptides analogues to PepA, a CPP obtained from the sequence of the dengue virus type 2 capsid protein, to improve its ability to translocate mouse brain endothelial cells. The PepA potential as drug delivery system to carry a single-domain antibody against Aβ peptide (sdAb) was also evaluated. Eighteen fusion proteins were genetically engineered, expressed and purified in order to have both properties: fluorescence intensity given by the green fluorescent protein (GFP) and the cell penetration functional ability given by the CPP. Eleven of these fusion proteins were randomly selected and their cell-penetrating predisposition was evaluated, as well as their cellular toxicity through an in vitro bEnd.3 cells model, using GFP and FD40 (FITC-labeled dextran with molecular weight of 40 kDa), respectively. The PepA showed 34.8% ± 6.4 of cellular uptake. In addition to PepA, four new designed peptides revealed to be potential CPPs – three of them are positively charged peptides (PepB, PepC and PepH) and, one (PepNeg) is negatively charged. The PepNeg was the only tested peptide that showed improved ability to translocate BBB (about 44.7% ± 3.5) and lower cellular toxicity, in comparison to PepA. The peptides different physicochemical properties suggests distinct internalization mechanisms between them. Moreover, the cellular uptake of the fusion protein sdAb_PepA was insignificant, probably due to a lack of functional activity of PepA as CPP. After the fusion protein transcytosis low percentage determined using western blot analysis, the functional activity maintenance of sdAb against Aβ1-42 when conjugated to PepA was investigated. Afterwards, the sdAb_PepA revealed high inhibitory amyloidogenic potential when the fibrillation kinetic was monitored by an in situ real-time Thioflavin T assay. In conclusion, four new CPPs were obtained from PepA, highlighting new possibilities for CNS related diseases treatment. Furthermore, the Aβ peptide accumulation decrease caused by sdAb suggests that one of these new CPPs conjugated to sdAb could be potentially useful in the treatment of AD.
Descrição
Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017
Palavras-chave
Péptidos translocadores de membranas Doença de Alzheimer Barreira hematoencefálica Péptido Aβ Anticorpos de domínio único Neurociências Teses de mestrado - 2017