Investigating the role of IL-17 producing γδ T cells in peripheral nerve regeneration

Ghilas, Vladimir

http://hdl.handle.net/10451/59270

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Authors

Ghilas, Vladimir

Advisor(s)

Ribot, Julie Cécile Caroline

Santos, Bruno Silva

Abstract(s)

A neuropatia periférica, definida como lesão ou disfunção dos nervos periféricos, está entre as doenças neurológicas mais comuns, afetando cerca de 2,4% da população mundial, aumentando com a idade até aos 8%. As lesões do sistema nervo periférico (LSNP) podem ser induzidas por incidentes como quedas, acidentes de carro, atividades desportivas ou intervenções médicas que podem levar ao alongamento, compressão, esmagamento ou excisão do nervo. Até 33% das LSNP resultam em perda da função sensorial e/ou motora, fraqueza profunda dos músculos inervados alvo e dor crônica. O sistema nervoso periférico (SNP), ao contrário do sistema nervoso central (SNC), tem a capacidade de regenerar através de um processo de grande envolvimento imunológico denominado Degeneração Walleriana (DW) caracterizado por degeneração do coto distal, limpeza dos detritos danificados e remodelação tecidual. A inflamação é fundamental para uma regeneração nervosa bem-sucedida - é o pilar que garante a progressão adequada da DW discutida anteriormente. Apesar disso, a descrição da função do sistema imune adaptativo neste contexto é muito limitada e principalmente focada em células T αβ. As células T γδ são pré-programadas durante o seu desenvolvimento para suas funções efetoras, deixando o timo já funcionalmente competentes para a produção de IFN-γ ou IL-17. Outra característica distintiva é o seu padrão de desenvolvimento tímico “por ondas” e a sua migração preferêncial para tecidos periféricos que está intimamente ligada às suas funções efetoras e à região variável da cadeia γ (Vγ) do seu recetor de células T. As células T γδ produtoras de IL-17 (células T γδ17) são uma população multifacetada, pois desencadeiam cancro e autoimunidade, mas induzem a defesa do hospedeiro contra patogenios, para além de contribuir para a manutenção da homeostase tecidual. As células T γδ17 regulam a memória de trabalho de curto prazo no SNC, promovem a regeneração óssea e muscular, bem como a inervação simpática do tecido adiposo. Dado o papel geral do sistema imune na regeneração do SNP, bem como as funções fisiológicas e na reparação tecidual das células T γδ17, hipotetizamos que esta subpopulação celular regula o processo de regeneração do sitemana nervoso periférico após uma lesão e, através dele, a recuperação motora. Ratinhos machos C57BL/6 foram submetidos a uma lesão unilateral por esmagamento do nervo ciático. Nervos e os nódulos linfáticos poplíteos foram dissecados em diferentes pontos de tempo para avaliação da cinética de acúmulação de células T γδ em vários pontos de tempo do processo regenerativo, bem como a caracterização da sua cadeia Vγ por citometria de fluxo (ratinhos Il17a+/+). Para além disso também foi avaliada a contribuição relativa de células produtoras de IL-17 presentes no nervo. A possível acúmulação e ativação de células T γδ17 foi investigada em ratinhos IL1R1 KO e IL23R KO e seu potencial de produção de citocinas foi avaliado em ratinhos WT por citometria de fluxo. A função motora de ratinhos Il17+/+ e Il17-/- foi avaliada através do índice de função ciática obtido através de um teste de caminhada antes e até 28 dias após a cirurgia de esmagamento do nervo ciático. Os níveis de expressão de marcadores de regeneração foram avaliados por microscopia de fluorescência (ratinhos Il17+/+ e Il17-/-). Após o esmagamento do nervo ciático, a frequência de células T γδ não apresentou diferenças nem no nervo nem nos nódulos linfáticos. Apesar disso, foi observado um aumento do número absoluto de células em ambos os tecidos entre os dias 1 e 3 pós-cirurgia. Das células T γδ que infiltram o nervo esmagado, a grande maioria foi negativa para a expressão de ambas as cadeias de TCR Vγ1 e Vγ4, sugerindo uma tendência potencial para o subconjunto Vγ6+. Tanto as células T γδ produtoras de IL-17 como de IFN-γ acumulam-se no nervo lesionado, embora com uma maior frequência de células T γδ17. Consistentemente com o perfil observado para o número total de células infiltrantes, o dia 3 permanece como o ponto de tempo de maior presença celular, embora os números de células T γδ produtoras de IFN-γ atinjam o pico no dia 1. As células T γδ17 também foram confirmadas como sendo as responsáveis pela produção da grande maioria de IL-17 dentro do nervo e a sua presença no local da lesão foi confirmada no dia 3 por microscopia confocal de fluorescência. As células T γδ isoladas do nervo lesado e do nódulo linfático ipsilateral não expressaram IL-17F, mas cerca de 20% dessas células eram IL-22+ nos dias 3 e 5. A IL-1 e IL-23 aparentemente não têm impacto nem na frequência nem no número absoluto de células T γδ presentes no nervo. Apesar disso influenciam a frequência e o número absoluto de células T γδ, mas as células T γδ17 especificamente. Em relação ao teste de caminhada, os ratinhos sem IL-17 são incapazes de recuperar sua função motora até aos níveis pré-operatórios ao contrário dos ratinhos Il17+/+. Ao nível histológico não observamos diferenças entre ratinhos Il17-/- e seus controlos experimentais de ninhada quanto à expressão de NF e MPZ. Por outro lado, demonstramos que os animais Il17-/- apresentaram 2 vezes menos expressão de BNDF antes da indução da lesão. Mais surpreendentemente, os ratinhos Il17-/- exibiram um aumento significativo na expressão de GAP-43 em comparação com seus controlos experimentais de ninhada no dia 7, principalmente na porção distal do local da lesão. Conforme discutido mais adiante, interpretamos que a expressão de GAP-43 poderá estar antecipada nos ratinhos Il17-/- ao longo dos pontos de tempo analisados quando comparados com ratinhos Il17+/+. O pico de acúmulação e atividade de células T γδ17 no dia 3 indica que a IL-17 secretada estará muito provavelmente a desempenhar um papel no microambiente nervoso. Foi demonstrado que a IL-17 reduz a síntese de mielina por células de Schwann, bem como uma diminuição no comprimento dos segmentos internodais in vitro, o que sugere um papel das células T γδ17 no controle da mielinização. Isso estaria de acordo com os requisitos para regeneração, uma vez que a mielinização deve ser interrompida neste ponto de tempo para permitir a progressão adequada do DW e o alongamento axonal, de modo a evitar aberrações no crescimento do nervo. Para além disso, nossos resultados apontam para um fenómeno em que não existe uma relação direta estabelecida entre a regeneração axonal e a recuperação da função motora efetiva. Parece haver um nível adequado de regeneração axonal (já que os nossos resultados indicam que o crescimento axonal aparentemente não é afetado pela falta de IL-17) que está associado a um baixo resultado funcional. Portanto, a recuperação deficiente da função motora observada em ratinhos Il17-/- pode resultar da transmissão prejudicada do impulso nervoso, possivelmente causada por plasticidade sináptica alterada, disfunção da junção neuromuscular ou aberrações na mielinização. Dado o papel proposto para a IL-17 derivada de células T γδ no controlo da mielinização, hipotetizamos que em ratinhos Il17-/-, a falta de sinalização inicial de IL-17 induziria uma produção de mielina descoordenada pelas células de Schwann. Embora a expressão de MPZ não estaja alterada em ratinhos Il17-/- (excluindo a possibilidade de hipo ou hipermielinização), isso não elimina possíveis problemas na estrutura ou no empacotamento da mielina. Como um todo, este trabalho sugere um papel crítico por parte das células T γδ17 na regeneração do sistema nervoso periférico, na qual a sua IL-17 atua na regulação dos eventos de mielinização que permitem a recuperação funcional motora. A longo prazo, esse projeto pode ser instrutivo para o desenvolvimento de estratégias que, por modulação desse processo, levem à melhora dos resultados clínicos após o LSNP. Apesar disso, mais investigação é necessárias para serem descobertos mecanismos pelos quais a IL-17 medeia o processo regenerativo.

The peripheral nervous system, contrary to the central nervous system, can regenerate through a process of major immunological involvement termed Wallerian Degeneration (WD) characterized by distal stump degeneration as well as tissue clearance and remodeling. Inflammation is critical for a successful nerve regeneration - it is the pillar that ensures appropriate progression of the WD. Notwithstanding this, our knowledge on the function of the adaptive immune system in this context is very limited. In this project, we analyze the contribution of IL-17 producing γδ T cells (γδ17 T cells), a multi-faceted population previously described to regulate steady state tissue pathophysiology. We hypothesize that this subset could also impact on the process of nerve regeneration after injury and through it, motor recovery. C57BL/6 male mice were submitted to the unilateral sciatic nerve crush injury. Nerves and popliteal lymph nodes were dissected and analyzed by flow cytometry for the evaluation of γδ T cell numbers and phenotype at various timepoints of the regenerative process. Our data showed an increase in the absolute numbers of γδ T cells, mostly IL-17 producers, in both tissues between days 1 to 3 post-surgery. This subset was also observed by fluorescence confocal microscopy within the lesion site day 3 after injury. Of note, γδ T cells were also confirmed to account for the vast majority of IL-17 producing cells within the nerve. To further assess the potential impact of IL-17 on motor recovery, we characterized the gait behavior of Il17+/+ and Il17-/- mice, evaluating their sciatic function index in the walking track test before and up to 28 days post-injury. Importantly, we observed that mice deficient in IL-17 were unable to fully recover their motor function to pre-operatory levels compared to their littermate controls. Finally, we analyzed the expression levels of nerve regeneration and myelination hallmarks by fluorescence microscopy. While we did not observe differences between Il17-/- mice and their littermate controls regarding the expression of neurofilament and myelin protein zero, we reported that Il17-/- animals displayed a 2-fold reduction in their expression of brain derived neurotrophic factor in the steady state condition. More strikingly, Il17-/- mice displayed a significant increase in the expression of growth-associated protein 43 compared to their littermate controls at day 7, mostly in the distal portion of the injury site. We interpret that the expression of GAP-43 might be anticipated in the Il17-/- mice throughout the analyzed timepoints when comparing with Il17+/+ mice. While further investigation is needed to uncover the mechanisms through which IL-17 mediates the regenerative process, we speculate that the deficient motor function recovery observed in Il17-/- mice may result from impaired nerve impulse transmission, possibly caused by altered synaptic plasticity, neuromuscular junction dysfunction or aberrations in myelination. Given the previously reported role for IL-17 in the control of myelination, we propose that in Il17-/- mice, the lack of early IL-17 signaling would induce an uncoordinated myelin production by Schwann cells. Although MPZ expression was not impaired in Il17-/- mice (excluding hypo or hypermyelination), it does not rule out possible problems in myelin structure or sheath packing. Altogether, this work suggests a critical role for γδ17 T cells in nerve regeneration, in which IL-17 acts towards the regulation of myelination events that allows for motor functional recovery. In the long run, this project might be instructive for the development of strategies that, by modulation of this process, would lead to the improvement of clinical outcomes after peripheral nerve injury.