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Publicação
Gene expression and phenotypical analysis of winner and loser cells engaged in cell competition
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Resumo(s)
O cancro continua a ser um dos maiores focos da comunidade científica, o que resulta em milhares de estudos publicados anualmente com o intuito de mitigar o aparecimento e avanço desta doença, já que está associada a uma crescente taxa de mortalidade. Diversos destes estudos focam-se no processo de oncogénese e nos mecanismos que promovem ou previnem a mesma. Recentemente, o estudo da Competição Celular (CC) revelou que este processo possui um papel importante durante a progressão tumoral. A CC é um mecanismo através do qual células mais aptas (“winners”) são selecionadas, por meio de eliminação de células menos aptas (“losers”), e é descrito como estando envolvido em vários processos fisiológicos, como a homeostasia e regeneração dos tecidos e também em algumas patologias como o cancro e doenças neurodegenerativas. A função da CC durante a oncogénese é, contudo, dependente do contexto, podendo atuar como um supressor ou promotor tumoral. No primeiro caso, a CC identifica células que possuam alterações potencialmente carcinogénicas, como mutações no HRAS e a sobre expressão de ERBB2, e promove a sua eliminação, impedindo assim eventuais transformações neoplásicas. Por outro lado, a CC pode ser manipulada pelas células tumorais para estas adquirirem mais espaço para proliferar, através da eliminação das células não tumorais circundantes. Coincidentemente, vários marcadores de CC têm sido associados a um pior prognóstico dos pacientes. Assim sendo, torna-se imperativo compreender os mecanismos de CC presentes no desenvolvimento tumoral. No entanto, ainda são desconhecidos os fatores que condicionam as funções da CC no cancro, assim como os principais reguladores da mesma. Com base nas evidências referidas, o objetivo deste projeto foi a identificação de genes cuja expressão desencadeasse fenómenos de CC em células de cancro colorretal, e determinar os impactos fenotípicos da mesma nas células. Desta forma, foi usado um modelo de co-cultura entre duas linhas celulares de cancro colorretal, LoVo e LS 174T. Foi observado um aumento significativo na apoptose das células LoVo após 48h de co cultura, enquanto que as LS 174T apresentaram um aumento de viabilidade e proliferação, em comparação com as respetivas condições de monocultura. De acordo com a definição canónica de CC, os resultados sugerem que as células LoVo, quando colocadas em co-cultura com as células LS 174T, são classificadas como “losers” e eliminadas, ao passo que as últimas assumem o papel de “winners”. Esta eliminação é dependente das proporções de células “winner” em co-cultura, sendo que a taxa de apoptose é amplificada quando estas se encontram em maioria. No entanto, um aumento no número total de células em cultura, mantendo as proporções, resulta numa mitigação da eliminação das “loser”. Estes resultados não só comprovam que esta eliminação é dependente da área da superfície de contacto entre “winner” e “loser”, e não de fatores humorais libertados pelas “winner”, como também indicam que a mesma depende do espaço disponível para a proliferação celular. Curiosamente, as “loser” apresentaram uma eliminação menos pronunciada às 72h, e as “winner” mantiveram a sua viabilidade acrescida, sugerindo que a duração do efeito da CC é diferente nos dois tipos de células. De forma a averiguar se a apoptose observada é ativada por caspases, o mesmo ensaio foi repetido na presença de emricasam, um inibidor de caspases. A eliminação das células “loser” foi completamente inibida, apesar da viabilidade das células “winner” ter permanecido inalterada. Surpreendentemente, as “loser” demonstraram também uma maior viabilidade. Estes dados propõem que as células “loser” são eliminadas num processo mediado por caspases, e indicam que podem estar presentes fatores secretados que exercem o seu efeito nas células “winner”, mas também nas células “loser” quando a apoptose é inibida. Coincidentemente, já foi previamente descrita uma proliferação compensatória dependente de apoptose, na qual a morte das células “loser” resulta numa maior proliferação das células “winner”. No entanto, a inibição da apoptose não alterou a taxa de proliferação das células “winner”, o que sugere que a proliferação não é dependente da apoptose das “loser”. Devido à aparente correlação entre vários marcadores de CC e a presença de metástases, a capacidade de migração das duas linhas celulares em co-cultura foi avaliada. Os diversos ensaios revelaram um aumento da migração das células “winner”, acoplado a uma marcada sobre-expressão de vimentina, o que sugere que a CC intervém na transição epitélio-mesênquima. A CC pode atuar durante todas as etapas da doença oncológica e afetar a resposta à terapêutica, pelo que foi testada a resposta à quimioterapia no modelo de co-cultura. A presença de oxaliplatina causou um aumento da viabilidade das células LoVo e, em contrapartida, um incremento na apoptose das células LS 174T. Este efeito poderá dever-se à maior taxa de proliferação das células “winner” em co-cultura, o que as torna mais vulneráveis à citotoxicidade da quimioterapia usada. Porém, é possível que fatores externos alterem o contexto da CC, pelo que o “fitness” das células é relativo e dependente do ambiente no qual estas se encontram. Assim sendo, nestas condições, as LoVo agem como “winner”, eliminando as LS 174T que agora se comportam como “loser”. A ideia de que algo extrínseco às células influência a CC é inovadora, e evidencia que esta pode contribuir à eliminação de células mais invasivas aquando do tratamento com agentes quimioterapêuticos. Com o intuito de identificar quais os genes, e respetivas vias de sinalização, potencialmente implicados em CC, foi realizada uma análise do transcriptoma, através de RNA-Seq. Para tal, a expressão génica das células “winner” e “loser” em co-cultura foi comparada com a respetiva monocultura. Após análise bioinformática e validação independente por RT-qPCR dos genes diferencialmente expressos, 8 genes foram identificados como sendo sobre-expressos nas células “winner”, e 3 genes foram identificados como sub-expressos nas células “loser”, quando as mesmas se encontram em co-cultura. O knock-down (KD) dos 8 genes nas células “winner” permitiu avaliar os seus efeitos fenotípicos na co-cultura. O KD dos genes AQP3, MYT1 e NRIP1 em particular bloqueou por completo a eliminação das células “loser”, sugerindo que o aumento da expressão destes é crucial à eliminação das “loser” em CC. Adicionalmente, genes inseridos em vias de sinalização previamente implicadas na oncogénese foram igualmente validados por RT-qPCR. Os resultados expõem um aumento da sinalização mTOR e JAK/STAT nas células “winner”, e uma diminuição destas nas células “loser”, o que poderá explicar as diferenças observadas na viabilidade e proliferação celular. Este projeto permitiu associar, pela primeira vez, a CC à migração celular e à modulação da resposta à quimioterapia em cancro do cólon. Adicionalmente, foi possível a identificação de novos genes cuja sobre-expressão é essencial para a eliminação das células “loser”. Este projeto constitui não só uma valiosa adição ao conhecimento atual sobre os mecanismos que regem a CC, como também poderá contribuir para o desenvolvimento de potenciais terapêuticas que a bloqueiem, atrasando a progressão tumoral.
Cancer remains a major focus of the scientific community, despite the growing efforts to thwart this pathology. Research continues to progress in order to counter the rising mortality rate, striving to better understand the natural process of oncogenesis. A very exciting topic is the implication of cell competition (CC) in cancer, where it can act as a tumour suppressor or promoter. Cell competition, a homeostasis mechanism, is responsible for comparing cells with their counterparts and promoting the elimination of the lesser fit ones. Although CC aims to maintain tissue health, several of its markers have been linked to a worse prognosis and metastasis development. Since CC may play a role in both cancer prevention and progression, understanding the molecular basis of this process would be invaluable. Thus, this project intended to unveil new genes which expression triggers CC in colorectal cancer cells, and to uncover the phenotypic impact that these cells suffer when engaging in CC. With this aim, a co-culture assay using two colorectal cancer cell lines, LoVo and LS 174T, was used. These cell lines were found to engage in CC, with LoVo being the “loser” cells, thus suffering elimination, and LS 174T the “winner” cells, with enhanced survival. The loser cells’ elimination was found to be caspase dependent, as the use of a pan-caspase inhibitor was sufficient to block the effect. To investigate other ways that CC influenced cells, a proliferation and a migration assay were carried out. During CC, winner cells exhibited a higher proliferation rate, which was not dependent on the apoptosis of the loser cells, while loser cells exhibited a lower proliferation. It was also found that winner cells migrated more in co-culture, whilst loser cells migrated less. Both these results suggest that CC transforms the winner cells into a more aggressive phenotype. Next, to study the influence of CC in response to cancer treatment, the co-culture assay was also repeated in the presence of oxaliplatin. A complete ablation of loser cell elimination was observed, with an increase in winner cell apoptosis, which can indicate that CC improves chemotherapy response in more invasive cells. To discover the genes implicated in the signal transduction of CC, an RNA-Seq was performed on the competing cells. This gene expression analysis revealed several genes which were upregulated on the winner cells during CC. These genes were knocked down (KD) in winner cells using shRNAs, followed by co-culture with non-altered loser cells, to test if their upregulation was necessary for CC occurrence. The knockdown of AQP3, MYT1 and NRIP1 abrogated CC, suggesting that the upregulation of each of them on the winner cells is necessary for the event. Overall, this project revealed new ways in which CC affects cell behaviour and unveiled novel genes necessary for cell competition, thus suggesting new targets for the future development of therapies with the potential to improve cancer prevention and hinder its progression.
Cancer remains a major focus of the scientific community, despite the growing efforts to thwart this pathology. Research continues to progress in order to counter the rising mortality rate, striving to better understand the natural process of oncogenesis. A very exciting topic is the implication of cell competition (CC) in cancer, where it can act as a tumour suppressor or promoter. Cell competition, a homeostasis mechanism, is responsible for comparing cells with their counterparts and promoting the elimination of the lesser fit ones. Although CC aims to maintain tissue health, several of its markers have been linked to a worse prognosis and metastasis development. Since CC may play a role in both cancer prevention and progression, understanding the molecular basis of this process would be invaluable. Thus, this project intended to unveil new genes which expression triggers CC in colorectal cancer cells, and to uncover the phenotypic impact that these cells suffer when engaging in CC. With this aim, a co-culture assay using two colorectal cancer cell lines, LoVo and LS 174T, was used. These cell lines were found to engage in CC, with LoVo being the “loser” cells, thus suffering elimination, and LS 174T the “winner” cells, with enhanced survival. The loser cells’ elimination was found to be caspase dependent, as the use of a pan-caspase inhibitor was sufficient to block the effect. To investigate other ways that CC influenced cells, a proliferation and a migration assay were carried out. During CC, winner cells exhibited a higher proliferation rate, which was not dependent on the apoptosis of the loser cells, while loser cells exhibited a lower proliferation. It was also found that winner cells migrated more in co-culture, whilst loser cells migrated less. Both these results suggest that CC transforms the winner cells into a more aggressive phenotype. Next, to study the influence of CC in response to cancer treatment, the co-culture assay was also repeated in the presence of oxaliplatin. A complete ablation of loser cell elimination was observed, with an increase in winner cell apoptosis, which can indicate that CC improves chemotherapy response in more invasive cells. To discover the genes implicated in the signal transduction of CC, an RNA-Seq was performed on the competing cells. This gene expression analysis revealed several genes which were upregulated on the winner cells during CC. These genes were knocked down (KD) in winner cells using shRNAs, followed by co-culture with non-altered loser cells, to test if their upregulation was necessary for CC occurrence. The knockdown of AQP3, MYT1 and NRIP1 abrogated CC, suggesting that the upregulation of each of them on the winner cells is necessary for the event. Overall, this project revealed new ways in which CC affects cell behaviour and unveiled novel genes necessary for cell competition, thus suggesting new targets for the future development of therapies with the potential to improve cancer prevention and hinder its progression.
Descrição
Tese de mestrado, Oncobiologia, 2021, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa
Palavras-chave
Competição celular Sequenciação de RNA Migração celular Progressão tumoral Resposta à quimioterapia Teses de mestrado - 2021