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Publicação
Social memory in zebrafish : behavioral assessment and the role of brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
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Autores
Resumo(s)
The ability of animals to gather information about their social and physical environment is essential for their ecological function. Animals are often organize conspecifics into categories (e.g. sex, age, hierarchical status). This social organization is underpinned by social recognition. Individuals use an assortment of different cues to obtain information about their environment and to recognize the individuals that they encounter. The present study evaluated the influence of 3 different sensory cues on social recognition: visual-only; olfactory-only and visual + olfactory. We used two different paradigms to assess social recognition memory – social discrimination paradigm and a habituation-dishabituation paradigm – both adapted from mouse studies. We also explored an asocial task – novel object test. A series of six experiments were performed by each individual. Subsequently, bdnf expression levels were evaluated in hippocampus and amygdala.
The behavioral results show that zebrafish: i) did not demonstrate preference for any of the objects presented 24h after the initial test; ii) preferentially associated with conspecifics that are novel, when using both chemical and visual cues; iii) exhibit preference for familiar conspecifics when only visually cues are accessible; iv) did not show preference between two individuals, when only chemical cues were available; v) failed to demonstrate social recognition memory using the habituation-dishabituation paradigm; vi) are highly inquisitive animals. The genetic expression analysis demonstrates no differences in bdnf expression levels in the amygdala. However, in the hippocampus, low-levels of bdnf were present when animals performed a discrimination paradigm based only on olfactory cues; in contrast with individuals that performed the same behavioral paradigm based on visual and visual + chemical cues. ). Here we propose that the high levels of BDNF observed in the Dl could affect LTP and consequently the production and secretion of OT in the Dm. Our findings present a new possibility for the role of neural connections between the Dl and Dm regions, mediated by BDNF, with significant impact on social memory.
We also evaluated the use of immediate early genes (c-fos and bdnf) as neural response markers in the zebrafish telencephalon. We analyzed animals that were submitted to a kainic acid treatment. To study the temporal response of IEG’s (c-fos and bdnf) to the treatment, an analysis of gene expression (qPCR) and protein levels (Western-blot) was performed. Animals were given intraperitoneal injections (0.5mg/Kg) of saline solution (control group) or kainic acid (treatment group) and sacrificed at different sampling time points (immediately after, 0min., 30min., 1h, 2h, 4h, 8h, 24h and 48h). The results show that c-fos suffered an up-regulation 30 min. after treatment; followed by an abrupt decrease in c-fos expression levels. However, protein levels did not show significant differences in C-FOS protein. Regarding bdnf: an up-regulation was observed 0min. after saline solution administration; 48h after administration of either KA or saline solution, a decrease in bdnf expression levels was observed. At the protein level both pro-BDNF and mature-BDNF levels were analyzed. Pro-BDNF levels increase 2h and 8h after saline solution administration; and 0min., 1h, 4h, 24h and 48h after KA administration. In contrast, mature-BDNF levels increase 0min. and 30min. after saline solution administration; and 0min., 1h, 2h, 4h, 8h, 24h and 48h after KA administration.
The present work demonstrates the usefulness of zebrafish in studying social memory, by the validation of paradigms to that effect. This work also suggests that the hippocampus possesses a role in this type of memory, depending on the origin of the cues employed.
Os comportamentos sociais requerem uma elevada flexibilidade comportamental, nos quais conhecimentos adquiridos a priori são fulcrais para a adaptação a novas situações. No reino animal, as espécies diferem na sua capacidade social: espécies sociais (gregárias) formam grupos sociais coesos e demonstram relações afiliativas entre os vários membros do grupo; contrariamente a espécies associais. Desta forma, espécies gregárias interagem diariamente com outras, onde a capacidade de armazenar e recordar informações se torna claramente importante. Na natureza, a capacidade de recordar informações relativas ao meio ambiente, relembrar a localização de estímulos recompensatórios e a identificação de indivíduos familiares, assume extrema importância do ponto de vista ecológico. O conhecimento que os animais adquirem acerca dos seus conspecíficos e a forma como constroem o conhecimento do mundo social circundante envolve, invariavelmente, a capacidade de categorizar os conspecíficos (por exemplo: idade, género, hierarquia, entre outros). A capacidade de distinguir indivíduos e armazenar essa informação durante longos períodos de tempo é uma vantagem social que facilita interacções posteriores e é essencial para os comportamentos sociais. O reconhecimento social tem como base características sensoriais multimodais que, conjuntamente, permitem o reconhecimento de indivíduos. Em condições laboratoriais, a memória social pode ser estudada recorrendo a dois paradigmas amplamente utilizados em roedores: teste de discriminação social binária e teste de habituação-desabituação. Ambos os paradigmas baseiam-se em alterações comportamentais espontâneas na exploração dos indivíduos, quando re-expostos a indivíduos familiares. O presente trabalho avalia a performance do peixe-zebra nas duas variantes do teste de memória social e num teste de memória asocial. Desta forma, 48 animais foram submetidos a uma série de seis paradigmas comportamentais. Cada indivíduo realizou os seguintes testes experimentais: 1) reconhecimento de objectos (O); reconhecimento social: 2) químico (C); 3) visual (V); 4) visual e químico (V+C); Teste de habituação-desabituação: 5) exploração de indivíduos novos (N+N); 6) exploração de individuos novos e familiares (N+F). Os animais foram inicialmente identificados (código de cores) para possibilitar a sua análise individual em cada teste. Ao longo das experiências os animais encontraram-se agrupados sem manterem contacto com os indivíduos “estímulo”. Os vídeos recolhidos durante aos experiências foram analisados utilizando um programa de video-tracking (Ethovision®). Para cada indivíduo foi calculado um score de preferência – relaciona o tempo de investigação de um estímulo com o tempo de investigação de ambos – e a taxa de exploração – relaciona a percentagem de tempo de exploração de ambos os estímulos tendo em conta o tempo total do teste. Os resultados comportamentais revelaram que: i) o peixe-zebra não demonstrou preferência por nenhum dos objectos apresentados 24 horas após o primeiro teste; ii) os indivíduos apresentaram preferência por indivíduos não-familiares quando a interação envolveu estímulos visuais e quiímicos; iii) apresentam preferência por indivíduos familiares quando a interacção tem por base estímulos somente visuais; iv) não demonstram preferência por nenhum dos indivíduos quando dispunham somente de estímulos químicos; v) o paradigma comportamental de habituação-desabituação não demonstrou preferência por animais novos ou familiares, 24h após o primeiro teste. Os resultados exploratórios revelaram que durante o primeiro dia de experiência, os indivíduos apresentaram taxas de exploração acima dos 50%, demonstrando a tendência natural do peixe-zebra em explorar novos estímulos. No entanto, 24 horas após o primeiro teste, os animais reduziram significativamente os níveis de exploração; sugerindo habituação ao teste do segundo dia. Inúmeros estudos têm sugerido a amigdala como a área cerebral onde a memória social está alocada, sugerindo os neuropeptidos (oxitocina e vasopressina) como reguladores deste tipo de memória. No entanto, até ao momento, nenhum estudo demonstrou o envolvimento do BDNF na memória social. Desde que o brain-derived neurotrophic factor (BDNF) provou estar envolvido em mecanismos de plasticidade sináptica, o seu papel em diversos mecanismos de memória e aprendizagem foi amplamente demonstrado. No processamento da memória, o BDNF pode actuar a vários níveis moleculares: regula canais iónicos como o canal de Na+ e canal de K+; modula receptores glutamatérgicos (NMDA e AMPA) e afecta a síntese proteica. Desta forma, o presente trabalho pretendeu avaliar o papel do BDNF na memória social. Os paradigmas comportamentais foram inicialmente balanceados, o que significa que cada grupo de animais terminaria o conjunto dos testes em paradigmas comportamentais diferentes. Desta forma, 2 horas após o térmito dos testes comportamentais os animais foram sacrificados. As áreas homólogas ao hipocampo (Dl) e à amigdala (Dm) foram extraídas e posteriormente analisados por qPCR. A análise da expressão genética demonstrou que os diferentes testes comportamentais produziam diferenças nos níveis de expressão do bdnf. Na amigdala, não se verificaram diferenças signicativas nos níveis de expressão do bdnf. No entanto, ao nível do hipocampo verificou-se que os indivíduos que realizaram o teste de memória social com base em estímulos químicos (C) possuia níveis de expressão de bdnf significativamente menores aos testes de memória social com base em estímulos visuais ou visuais (V) e químicos (V+C ). Por outro lado, foi possível correlacionar o teste de memória social com a sociabilidade. Desta forma, foi possível estabelecer uma correlação significativa entre os indivíduos mais sociais e os que apresentam maior capacidade de reconhecimento na realização do teste de memória social. O último objectivo do trabalho pretendia perceber a forma como os genes de expressão imediata (immediate early genes – IEG’s) poderão funcionar como marcadores de resposta neural. Desta forma, foram analisados 128 animais submetidos a um tratamento com ácido kaínico para posterior análise do c-fos e bdnf. Os indivíduos foram injectados intraperitonialmente com 0.5mg/Kg de ácido kainico (grupo tratamento) ou solução salina (grupo controlo) e, posteriormente, sacrificados a diferentes tempos de amostragem (imediatamente após a injecção; 0 minutos; 30 minutos; 1 hora; 2 horas; 4 horas; 8 horas; 24 horas; 48 horas após a injecção). Posteriormente, os cérebros foram recolhidos e dissecaram-se as 5 principais macroareas: telencéfalo; diencéfalo; tecto óptico; cerebelo e tronco cerebral. Em cada individuo, foi realizado um corte sagital entre os dois hemisférios cerebrais; metade do cérebro foi alocado para a análise da expressão génica (qPCR) enquanto o restante foi utilizada para avaliar os níveis proteicos (Western-blot). Os resultados revelaram que, após um insulto externo, ocorre um aumento significativo nos níveis de expressão do c-fos após 30 minutos. Subsequentemente, regista-se uma diminuição abrupta da expressão de c-fos que se mantém ao longo de 48 horas. No entanto, os resultados da análise proteica não revelaram diferenças significativas nos níveis de proteinas do C-FOS ao longo do tempo e entre os tratamentos (controlo vs tratamento). Relativamente ao bdnf, verificou-se um aumento significativo nos níveis expressão 0 minutos após a administração de uma substância salina, que se mantém no mínimo até 24 horas. 48 horas após a administração, ambos os tratamentos (ácido kaínico e solução salina) diminuem significativamente os níveis de expressão do bdnf. A nível proteico, avaliou-se as duas isoformas do BDNF – pro-BDNF e mature-BDNF. Os níveis da isoforma pro-BDNF sofrem um aumento significativo 2 e 8 horas após a administração da solução salina; e 0, 1, 4, 24 e 48 horas após a administração do ácido kaínico. A isoforma mature-BDNF revelou um aumento significativo 0 e 30 minutos após a administração da solução salina; e 0 minutos, 1h, 2h, 4h, 8h, 24h e 48h após a administração do ácido kaínico. Os resultados obtidos pretendem demonstrar a utilidade do peixe-zebra no estudo da memória social, através da validação de paradigmas comportamentais para esse efeito. Por outro lado, demonstrámos que o hipocampo tem um papel neste tipo de memória que é dependente da origem sensorial dos estímulos utilizados.
Os comportamentos sociais requerem uma elevada flexibilidade comportamental, nos quais conhecimentos adquiridos a priori são fulcrais para a adaptação a novas situações. No reino animal, as espécies diferem na sua capacidade social: espécies sociais (gregárias) formam grupos sociais coesos e demonstram relações afiliativas entre os vários membros do grupo; contrariamente a espécies associais. Desta forma, espécies gregárias interagem diariamente com outras, onde a capacidade de armazenar e recordar informações se torna claramente importante. Na natureza, a capacidade de recordar informações relativas ao meio ambiente, relembrar a localização de estímulos recompensatórios e a identificação de indivíduos familiares, assume extrema importância do ponto de vista ecológico. O conhecimento que os animais adquirem acerca dos seus conspecíficos e a forma como constroem o conhecimento do mundo social circundante envolve, invariavelmente, a capacidade de categorizar os conspecíficos (por exemplo: idade, género, hierarquia, entre outros). A capacidade de distinguir indivíduos e armazenar essa informação durante longos períodos de tempo é uma vantagem social que facilita interacções posteriores e é essencial para os comportamentos sociais. O reconhecimento social tem como base características sensoriais multimodais que, conjuntamente, permitem o reconhecimento de indivíduos. Em condições laboratoriais, a memória social pode ser estudada recorrendo a dois paradigmas amplamente utilizados em roedores: teste de discriminação social binária e teste de habituação-desabituação. Ambos os paradigmas baseiam-se em alterações comportamentais espontâneas na exploração dos indivíduos, quando re-expostos a indivíduos familiares. O presente trabalho avalia a performance do peixe-zebra nas duas variantes do teste de memória social e num teste de memória asocial. Desta forma, 48 animais foram submetidos a uma série de seis paradigmas comportamentais. Cada indivíduo realizou os seguintes testes experimentais: 1) reconhecimento de objectos (O); reconhecimento social: 2) químico (C); 3) visual (V); 4) visual e químico (V+C); Teste de habituação-desabituação: 5) exploração de indivíduos novos (N+N); 6) exploração de individuos novos e familiares (N+F). Os animais foram inicialmente identificados (código de cores) para possibilitar a sua análise individual em cada teste. Ao longo das experiências os animais encontraram-se agrupados sem manterem contacto com os indivíduos “estímulo”. Os vídeos recolhidos durante aos experiências foram analisados utilizando um programa de video-tracking (Ethovision®). Para cada indivíduo foi calculado um score de preferência – relaciona o tempo de investigação de um estímulo com o tempo de investigação de ambos – e a taxa de exploração – relaciona a percentagem de tempo de exploração de ambos os estímulos tendo em conta o tempo total do teste. Os resultados comportamentais revelaram que: i) o peixe-zebra não demonstrou preferência por nenhum dos objectos apresentados 24 horas após o primeiro teste; ii) os indivíduos apresentaram preferência por indivíduos não-familiares quando a interação envolveu estímulos visuais e quiímicos; iii) apresentam preferência por indivíduos familiares quando a interacção tem por base estímulos somente visuais; iv) não demonstram preferência por nenhum dos indivíduos quando dispunham somente de estímulos químicos; v) o paradigma comportamental de habituação-desabituação não demonstrou preferência por animais novos ou familiares, 24h após o primeiro teste. Os resultados exploratórios revelaram que durante o primeiro dia de experiência, os indivíduos apresentaram taxas de exploração acima dos 50%, demonstrando a tendência natural do peixe-zebra em explorar novos estímulos. No entanto, 24 horas após o primeiro teste, os animais reduziram significativamente os níveis de exploração; sugerindo habituação ao teste do segundo dia. Inúmeros estudos têm sugerido a amigdala como a área cerebral onde a memória social está alocada, sugerindo os neuropeptidos (oxitocina e vasopressina) como reguladores deste tipo de memória. No entanto, até ao momento, nenhum estudo demonstrou o envolvimento do BDNF na memória social. Desde que o brain-derived neurotrophic factor (BDNF) provou estar envolvido em mecanismos de plasticidade sináptica, o seu papel em diversos mecanismos de memória e aprendizagem foi amplamente demonstrado. No processamento da memória, o BDNF pode actuar a vários níveis moleculares: regula canais iónicos como o canal de Na+ e canal de K+; modula receptores glutamatérgicos (NMDA e AMPA) e afecta a síntese proteica. Desta forma, o presente trabalho pretendeu avaliar o papel do BDNF na memória social. Os paradigmas comportamentais foram inicialmente balanceados, o que significa que cada grupo de animais terminaria o conjunto dos testes em paradigmas comportamentais diferentes. Desta forma, 2 horas após o térmito dos testes comportamentais os animais foram sacrificados. As áreas homólogas ao hipocampo (Dl) e à amigdala (Dm) foram extraídas e posteriormente analisados por qPCR. A análise da expressão genética demonstrou que os diferentes testes comportamentais produziam diferenças nos níveis de expressão do bdnf. Na amigdala, não se verificaram diferenças signicativas nos níveis de expressão do bdnf. No entanto, ao nível do hipocampo verificou-se que os indivíduos que realizaram o teste de memória social com base em estímulos químicos (C) possuia níveis de expressão de bdnf significativamente menores aos testes de memória social com base em estímulos visuais ou visuais (V) e químicos (V+C ). Por outro lado, foi possível correlacionar o teste de memória social com a sociabilidade. Desta forma, foi possível estabelecer uma correlação significativa entre os indivíduos mais sociais e os que apresentam maior capacidade de reconhecimento na realização do teste de memória social. O último objectivo do trabalho pretendia perceber a forma como os genes de expressão imediata (immediate early genes – IEG’s) poderão funcionar como marcadores de resposta neural. Desta forma, foram analisados 128 animais submetidos a um tratamento com ácido kaínico para posterior análise do c-fos e bdnf. Os indivíduos foram injectados intraperitonialmente com 0.5mg/Kg de ácido kainico (grupo tratamento) ou solução salina (grupo controlo) e, posteriormente, sacrificados a diferentes tempos de amostragem (imediatamente após a injecção; 0 minutos; 30 minutos; 1 hora; 2 horas; 4 horas; 8 horas; 24 horas; 48 horas após a injecção). Posteriormente, os cérebros foram recolhidos e dissecaram-se as 5 principais macroareas: telencéfalo; diencéfalo; tecto óptico; cerebelo e tronco cerebral. Em cada individuo, foi realizado um corte sagital entre os dois hemisférios cerebrais; metade do cérebro foi alocado para a análise da expressão génica (qPCR) enquanto o restante foi utilizada para avaliar os níveis proteicos (Western-blot). Os resultados revelaram que, após um insulto externo, ocorre um aumento significativo nos níveis de expressão do c-fos após 30 minutos. Subsequentemente, regista-se uma diminuição abrupta da expressão de c-fos que se mantém ao longo de 48 horas. No entanto, os resultados da análise proteica não revelaram diferenças significativas nos níveis de proteinas do C-FOS ao longo do tempo e entre os tratamentos (controlo vs tratamento). Relativamente ao bdnf, verificou-se um aumento significativo nos níveis expressão 0 minutos após a administração de uma substância salina, que se mantém no mínimo até 24 horas. 48 horas após a administração, ambos os tratamentos (ácido kaínico e solução salina) diminuem significativamente os níveis de expressão do bdnf. A nível proteico, avaliou-se as duas isoformas do BDNF – pro-BDNF e mature-BDNF. Os níveis da isoforma pro-BDNF sofrem um aumento significativo 2 e 8 horas após a administração da solução salina; e 0, 1, 4, 24 e 48 horas após a administração do ácido kaínico. A isoforma mature-BDNF revelou um aumento significativo 0 e 30 minutos após a administração da solução salina; e 0 minutos, 1h, 2h, 4h, 8h, 24h e 48h após a administração do ácido kaínico. Os resultados obtidos pretendem demonstrar a utilidade do peixe-zebra no estudo da memória social, através da validação de paradigmas comportamentais para esse efeito. Por outro lado, demonstrámos que o hipocampo tem um papel neste tipo de memória que é dependente da origem sensorial dos estímulos utilizados.
Descrição
Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2015
Palavras-chave
Memória Peixe-zebra Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) Hipocampo Teses de mestrado - 2015