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Helicobacter pylori prophages : distribution, diversity and contribution to bacterial fitness and pathogenicity

Publication . Domingos, Carolina Marques; Oleastro, Mónica; Dionísio, Francisco

Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa que coloniza cronicamente o estômago de metade da população mundial. A infeção leva à inflamação crónica, e em muitos casos permanece assintomática, mas, em cerca de 20% dos indivíduos infetados, pode levar ao desenvolvimento de várias doenças do trato digestivo, incluindo gastrite crónica, úlcera gástrica ou duodenal, linfoma do tecido associado à mucosa gástrica e cancro gástrico. A infeção por H. pylori difere a nível geográfico e estrato socioeconómico, e nos países em desenvolvimento apresenta uma taxa de 80% de infeção da população, enquanto em países desenvolvidos o número é muito inferior, com taxa de 40%. A prevalência desta bactéria aumenta quando as condições socioeconómicas são precárias, particularmente, as condições de vida em criança que é considerado um fator determinante importante na aquisição da infeção. Estima-se que a infeção ocorre a partir de uma transmissão vertical (pessoa-a-pessoa) via gastro-oral, oral-oral, fecal-oral ou ambos. Para além disso, outra possível forma de transmissão horizontal é através de alimentos contaminados, apesar de esta bactéria sobreviver por um período curto em comida refrigerada e sistemas de distribuição de água. A infeção por H. pylori pode ser erradicada com uma terapia de antibióticos, mas na última década a emergência de estirpes resistentes aumentou de forma drástica. A plasticidade do genoma bacteriano pode explicar o alto nível de adaptabilidade de H. pylori e o seu sucesso como agente patogénico humano. O processo de colonização é facilitado e induz inflamação através de vários fatores de virulência que estão associados com o risco de doenças gástricas severas, como adesinas, motilidade, urease, ilha de patogenicidade Cag e citotoxina vacuolizante. A grande diversidade genética de H. pylori, que é uma bactéria naturalmente competente, pode ser explicada pelo facto de ter uma alta frequência de mutação através do rearranjo do DNA e transferência horizontal de genes (HGT). Estes mecanismos de transferência horizontal são mediados por elementos móveis de DNA como plasmídeos, transposões e fagos, que são cruciais para a evolução bacteriana e plasticidade genómica. Esta bactéria consegue então adquirir genes de virulência e resistência a antibióticos, alterando a sua patogenicidade. Para além disto, a grande variabilidade genética entre estirpes está associada com a população ou a sua origem geográfica, pois a colonização crónica no estômago permitiu que H. pylori evoluísse estratégias de sobrevivência em paralelo com o seu hospedeiro natural, muito antes dos humanos saírem do continente africano. As migrações humanas ao longo do tempo resultaram numa diversidade biogeográfica desta bactéria formando as seguintes populações: hpAfrica1, hpAfrica2, hpNEAfrica, hpSahul, hpAsia2, hpEurope and hpEastAsia. Os bacteriófagos (fagos) são vírus que infetam exclusivamente bactérias e são considerados como o agente biológico mais abundante da Terra, mas estima-se que apenas 1% foi descrito ou identificado. Os fagos podem ser líticos, lisogénicos ou pseudolisogénicos. Num ciclo de replicação lítico, o fago invade o hospedeiro usa os recursos da célula para produzir o seu genoma e proteínas da cápside e provoca a lise libertando múltiplas cópias do vírus. No ciclo de replicação lisogénico, o bacteriófago integra-se no genoma da bactéria ou torna-se um elemento epissomal. Quando a bactéria se multiplica passa à sua progenia o genoma do fago. No entanto, em resposta a alterações ambientais este fago pode entrar num ciclo lítico e elimina o hospedeiro. No ciclo pseudolisogénico, o fago não entra numa via lítica nem se integra no genoma da bactéria o que acontece em hospedeiros com deficiência de nutrientes o que resulta num fago não integrado, semelhante a um epissoma e sobrevive durante um longo período. Uma vez que o status nutricional é restaurado o fago entra num ciclo lítico ou lisogénico. Os bacteriófagos são veículos importantes no processo de HGT entre várias espécies bacterianas e causam a transferência de diferentes genes envolvidos em comportamentos biológicos bacterianos. Com isto, o fago pode expressar genes que não são necessários para o seu ciclo de vida mas beneficiam o hospedeiro, que dependendo do valor de pressão seletiva podem levar à expansão clonal dos mesmos. H. pylori apresenta sequências de profago no seu genoma, que podem formar um profago completo, ou apenas remanescentes, e que estão presentes em cerca de 20% das estirpes, segundo a literatura. Esta diversidade genética adicional pode fornecer vantagens metabólicas ou mecanismos de tolerância que aumentem o fitness da bactéria e ajudar a colonizar diferentes populações humanas. Estas sequências do fago são diferentes entre si e são caracterizadas pela distribuição filogeográfica formando populações: hpAfrica1, hpEastAsia, hpNEurope and hpSWEurope. Existe uma semelhança filogeográfica entre genes do fago e da bactéria o que sugere uma coevolução entre o vírus e o seu hospedeiro. No entanto, ainda não se sabe se funções específicas dos fagos em H. pylori contribuem para o aumento de patogenicidade ou associação a estados específicos de doenças. O objetivo deste estudo foi avaliar a importância de profagos na evolução de H. pylori, como os profagos evoluem no genoma bacteriano e se a presença destes afeta o fitness e patogenicidade de H. pylori. Com isto avaliou-se a distribuição dos profagos em 256 isolados clínicos de H. pylori de diferentes pacientes portugueses e correlacionou-se com dados clínicos, demográficos, resistência aos antibióticos e genes de virulência. Observou-se que mais de metade da população em estudo era constituída por adultos (59.8%) e a maior parte (60.2%) era constituída por pacientes do sexo feminino. Relativamente à distribuição de resistência a antibióticos das estirpes de H. pylori, 65.6% apresentava pelo menos uma resistência a uma família de antibióticos e 16% da população apresentava resistência a mais do que uma família de antibióticos. As resistências mais comuns de antibióticos foram ao metronidazole (43%), eritromicina (43%) e ciprofloxacina (30%). A frequência de genes de profago em H. pylori foi de 38%, valor superior relativamente ao que já foi descrito, o que sugere que a presença de profagos no genoma de H. pylori é mais abrangente em relação ao que se assumia originalmente. Com uma percentagem de 91% para a presença do gene integrase e 9% para a presença dos genes integrase e holina, sugerindo a presença de remanescentes de fagos na maioria dos casos. Nestas estirpes avaliouse a presença do alelo s1 e s2 para o gene vacA e do gene cagA. Concluiu-se que a maioria das estirpes apresentava o alelo s2 (63%) e era cagA negativa (64%). A alta percentagem da presença de genes de profago pode indicar a importância da diversificação do genoma bacteriano e fitness e ter um papel importante em processos de adaptação contribuindo para a evolução da virulência. A correlação entre outras bactérias hospedeiras e a presença de profagos e virulência já foi descrita, mas neste caso não se encontrou correlação entre a presença de genes de profagos e: i) e a resistência da bactéria a antibióticos; ii) a presença do gene cagA e a forma alélica mais tóxica de vacA; iii), e fatores sociodemográficos como a distribuição etária, o género dos pacientes e o tratamento prévio para H. pylori. No entanto, não se pode excluir a possibilidade de existir uma possível correlação entre a existência de genes de profagos e outros factores de virulência não pesquisados no presente estudo, como já foi descrito em bactérias como por exemplo Escherichia coli e Bacillus subtilis. De seguida, fez-se uma análise do genoma dos profagos e uma reconstrução filogenética a partir do gene fágico da integrase deste grupo de estirpes; a árvore resultante revelou quatro clusters que correspondem às populações de prophage sequence typing (PST) que foram hpAfrica1, hpEastAsia, hpSWEurope e hpNEurope. Esta análise ilustrou e corroborou a conservação dos locais de inserção e a diversidade da estrutura populacional dos profagos de H. pylori e sugere um indicativo forte biogeográfico na diversidade genética do gene integrase. Estes resultados são consistentes com o modelo de coevolução entre vírus e hospedeiro. Para avaliar a performance de formação de biofilmes com a presença de profagos, construiu-se mutantes profago-knockout a partir da substituição do gene da integrase por uma cassete de resistência à canamicina. De cinco estirpes selecionadas, apenas uma estirpe (ALG001) foi transformada com sucesso. No estudo de formação de biofilmes observou-se que a estirpe wild-type ALG001 apresentava uma alta produção de biofilmes e a estirpe mutante ALG001 era produtora, embora fraca, de biofilmes, com uma diferença relevante a nível estatístico o que pode significar que a presença de profago pode influenciar a virulência de H. pylori. Para além disto, determinou-se a composição da matrix de biofilmes da estirpe ALG001 através de um tratamento com proteinase K e DNase I a diferentes concentrações e observou-se uma redução na produção de biofilme, tendo-se identificado que as proteínas são fundamentais na formação de biofilmes tanto na estirpe wild-type como na estirpe mutante. Portanto, para progredir neste tópico, será necessário realizar mais estudos no futuro para validar e clarificar as funções específicas dos profagos em H. pylori e o seu papel na virulência deste importante agente patogénico.

2023Master thesis

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Author Correction: Repeated out-of-Africa expansions of Helicobacter pylori driven by replacement of deleterious mutations

Publication . Thorpe, Harry A; Tourrette, Elise; Yahara, Koji; Vale, Filipa F.; Liu, Siqi; Oleastro, Mónica; Alarcon, Teresa; Perets, Tsachi-Tsadok; Latifi-Navid, Saeid; Yamaoka, Yoshio; Martinez-Gonzalez, Beatriz; Karayiannis, Ioannis; Karamitros, Timokratis; Sgouras, Dionyssios N.; Elamin, Wael; Pascoe, Ben; Sheppard, Samuel K.; Ronkainen, Jukka; Aro, Pertti; Engstrand, Lars; Agreus, Lars; Suerbaum, Sebastian; Thorell, Kaisa; Falush, Daniel

2023-03-20Journal article

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Repeated out-of-Africa expansions of Helicobacter pylori driven by replacement of deleterious mutations

Helicobacter pylori lives in the human stomach and has a population structure resembling that of its host. However, H. pylori from Europe and the Middle East trace substantially more ancestry from modern African populations than the humans that carry them. Here, we use a collection of Afro-Eurasian H. pylori genomes to show that this African ancestry is due to at least three distinct admixture events. H. pylori from East Asia, which have undergone little admixture, have accumulated many more non-synonymous mutations than African strains. European and Middle Eastern bacteria have elevated African ancestry at the sites of these mutations, implying selection to remove them during admixture. Simulations show that population fitness can be restored after bottlenecks by migration and subsequent admixture of small numbers of bacteria from non-bottlenecked populations. We conclude that recent spread of African DNA has been driven by deleterious mutations accumulated during the original out-of-Africa bottleneck.

2022-11-11Journal article

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Molecular detection of Helicobacter pyloriand its genotypic antimicrobial resistance patterns in dyspeptic Mozambican patients

Publication . Ismail, Muhammad Ahamed; Majaliwa, Nashon D.; Vale, Filipa F.; Cumbana, Roqueia; Sumbana, José J.; Muchongo, Arsénio; Nassone, Ema; Loforte, Michella; Mondlane, Liana; Botão, Edília; Taviani, Elisa; Carrilho, Carla; Vítor, Jorge M. B.; Sacarlal, Jahit

Background Helicobacter pylori strains show a high level of genotypic diversity and express several genes that contribute to their pathogenicity and resistance. In Mozambique, there is lack of information regarding its resistance pattern to antibiotics. In this study, we aimed to investigate the prevalence of H. pylori and its genotypic resistance to clarithromycin, metronidazole, and fluoroquinolones in Mozambican dyspeptic patients. Since appropriate eradication should be based on the local resistance rate, our data will guide clinicians in choosing the best drugs for the effective treatment of H. pylori-infected patients. Methods This is a cross-sectional descriptive study conducted between June 2017 and June 2020, in which 171 dyspeptic patients were recruited, and through upper gastrointestinal endoscopy, gastric biopsies were collected from those patients. Polymerase chain reaction was performed for the detection of H. pylori and its resistance mechanisms to clarithromycin (23S rRNA), metronidazole (rdxA), and fluoroquinolones (gyrA); mutations conferring resistance to these antibiotics were investigated by sequencing 23S rRNA, rdxA, and gyrA genes. Results Of the 171 samples tested, H. pylori was detected in 56.1% (96/171). The clarithromycin resistance rate was 10.4% (the responsible mutations were A2142G and A2143G), the metronidazole resistance rate was 55.2% (4 types of mutations responsible for metronidazole resistance were identified which include, D59N, R90K, H97T, and A118T. However, in many cases, they appeared in combination, with D59N + R90K + A118T being the most frequent combination), and the fluoroquinolones resistance rate was 20% (the responsible mutations were N87I and D91G). Conclusion H. pylori infection remains common in dyspeptic Mozambican patients. High resistance to metronidazole and fluoroquinolones requires continuous monitoring of antibiotic resistance and adaptation of therapy to eradicate this infection.

2023-06-20Journal article

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Biomarker Characterization and Prediction of Virulence and Antibiotic Resistance from Helicobacter pylori Next Generation Sequencing Data

Publication . Vital, Joana S.; Tanoeiro, Luis; Lopes-Oliveira, Ricardo; Vale, Filipa F.

The Gram-negative bacterium Helicobacter pylori colonizes c.a. 50% of human stomachs worldwide and is the major risk factor for gastric adenocarcinoma. Its high genetic variability makes it difficult to identify biomarkers of early stages of infection that can reliably predict its outcome. Moreover, the increasing antibiotic resistance found in H. pylori defies therapy, constituting a major human health problem. Here, we review H. pylori virulence factors and genes involved in antibiotic resistance, as well as the technologies currently used for their detection. Furthermore, we show that next generation sequencing may lead to faster characterization of virulence factors and prediction of the antibiotic resistance profile, thus contributing to personalized treatment and management of H. pylori-associated infections. With this new approach, more and permanent data will be generated at a lower cost, opening the future to new applications for H. pylori biomarker identification and antibiotic resistance prediction.

2022-05-11Journal article

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