Untitled

Funder

Organizational Unit

Publications

Age-dependent microglia inflammatory profile in the spinal cord of the ALS mSOD1G93A mice

Publication . Roberto, Afonso Sabino Ferreira; Botelho, Ana Rita Mendonça Vaz; Brites, Dora Maria Tuna de Oliveira

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal e heterogénea, caracterizada pela perda progressiva de neurónios motores e neuroinflamação. A microglia-associada-a-doença (MAD) desempenha um papel crucial, adotando fenótipos neurotóxicos ao longo da progressão de patologias. Além disso, existe evidência de que a disfunção microglial está relacionada com variações, dependentes da idade, em marcadores inflamatórios. Contudo, essa variação e os seus mecanismos moleculares subjacentes permanecem pouco compreendidos na patogénese da ELA. Neste contexto, é essencial investigar os microRNAs (miRNAs) associados à inflamação, uma vez que são reguladores importantes da inflamação durante a progressão da doença e têm potencial terapêutico como alvos de modulação. O objetivo deste estudo é investigar o perfil inflamatório de miRNAs e os estádios reativos, dependentes da idade, na microglia espinhal de murganhos com mutação G93A no gene da superóxido dismutase-1, modelo mSOD1G93A de ELA. Assim, foram utilizadas culturas primárias de microglia espinhal de murganhos recém-nascidos mSOD1G93A (TG) e selvagens (WT) e analisados miRNAs inflamatórios (miR-21, miR-124, miR-125b, miR-146a e miR-155) e marcadores inflamatórios/fagocíticos (TNF-α, ARG1, iNOS, TREM2 e MFG-E8) aos 2, 10 e 16 dias in vitro (DIV), simulando as fases jovem/reativa, madura e envelhecida/senescentes, respetivamente. Os resultados obtidos revelam alterações dinâmicas na expressão de miRNAs com a idade, que se correlacionam com mudanças funcionais da microglia, de um estado reativo para um estado pouco responsivo. A microglia mSOD1 aos 2 DIV apresentou sobre-expressão do miR-124 e um fenótipo pró-inflamatório (sobre-expressão de iNOS e MFG-E8 e sub-expressão de ARG1). Aos 10 DIV, a microglia mSOD1 apresentou sub-expressão de miR-125b e miR-155a, associada à expressão aumentada de TNF-α e TREM2, possivelmente contribuindo para um perfil neurotóxico e inflamação crónica. Aos 16 DIV, encontrou-se um padrão misto na microglia mSOD1, caracterizado pela diminuição de miR-146a e sub-expressão de marcadores pró- e anti-inflamatórios, respetivamente TNF-α e ARG1. Em suma, estes resultados demonstram um perfil complexo de miRNAs, dependente da idade, na microglia mSOD1, que transita de uma reatividade pró-inflamatória para um fenótipo mais disfuncional e de inflamação mista. A modulação específica destes miRNAs, regulando essas transições e restabelecendo a neuroprotecção, pode fornecer terapêuticas promissoras para a ELA.

2024-11-22Master thesis

Embargoed access

Improving human mesenchymal stem cell-derived hepatic cell energy metabolism by manipulating glucose homeostasis and glucocorticoid signaling

Publication . Rodrigues, Joana S.; Faria-Pereira, Andreia; Camões, Sérgio P.; Serras, Ana S.; Morais, Vanessa A.; Ruas, Jorge Lira; Miranda, Joana P

Introduction: The development of reliable hepatic in vitro models may provide insights into disease mechanisms, linking hepatocyte dysmetabolism and related pathologies. However, several of the existing models depend on using high concentrations of hepatocyte differentiation-promoting compounds, namely glucose, insulin, and dexamethasone, which is among the reasons that have hampered their use for modeling metabolism-related diseases. This work focused on modulating glucose homeostasis and glucocorticoid concentration to improve the suitability of a mesenchymal stem-cell (MSC)-derived hepatocyte-like cell (HLC) human model for studying hepatic insulin action and disease modeling. Methods: We have investigated the role of insulin, glucose and dexamethasone on mitochondrial function, insulin signaling and carbohydrate metabolism, namely AKT phosphorylation, glycogen storage ability, glycolysis and gluconeogenesis, as well as fatty acid oxidation and bile acid metabolism gene expression in HLCs. In addition, we evaluated cell morphological features, albumin and urea production, the presence of hepatic-specific markers, biotransformation ability and mitochondrial function. Results: Using glucose, insulin and dexamethasone levels close to physiological concentrations improved insulin responsiveness in HLCs, as demonstrated by AKT phosphorylation, upregulation of glycolysis and downregulation of Irs2 and gluconeogenesis and fatty acid oxidation pathways. Ammonia detoxification, EROD and UGT activities and sensitivity to paracetamol cytotoxicity were also enhanced under more physiologically relevant conditions. Conclusion: HLCs kept under reduced concentrations of glucose, insulin and dexamethasone presented an improved hepatic phenotype and insulin sensitivity demonstrating superior potential as an in vitro platform for modeling energy metabolism-related disorders, namely for the investigation of the insulin signaling pathway.

2023Journal article

Open access

Spatiotemporal dysregulation of neuron-glia related genes and pro-/anti-inflammatory mirnas in the 5xFAD mouse model of Alzheimer’s diseaseouse model of Alzheimer’s disease

Publication . Ianni, Marta; Corraliza-Gomez, Miriam; Costa-Coelho, Tiago; Ferreira-Manso, Mafalda; Inteiro-Oliveira, Sara; Alemãn-Serrano, Nuno; Sebastião, Ana M; Garcia, Gonçalo; Diógenes, Maria José; Brites, Dora

Alzheimer's disease (AD), the leading cause of dementia, is a multifactorial disease influenced by aging, genetics, and environmental factors. miRNAs are crucial regulators of gene expression and play significant roles in AD onset and progression. This exploratory study analyzed the expression levels of 28 genes and 5 miRNAs (miR-124-3p, miR-125b-5p, miR-21-5p, miR-146a-5p, and miR-155-5p) related to AD pathology and neuroimmune responses using RT-qPCR. Analyses were conducted in the prefrontal cortex (PFC) and the hippocampus (HPC) of the 5xFAD mouse AD model at 6 and 9 months old. Data highlighted upregulated genes encoding for glial fibrillary acidic protein (Gfap), triggering receptor expressed on myeloid cells (Trem2) and cystatin F (Cst7), in the 5xFAD mice at both regions and ages highlighting their roles as critical disease players and potential biomarkers. Overexpression of genes encoding for CCAAT enhancer-binding protein alpha (Cebpa) and myelin proteolipid protein (Plp) in the PFC, as well as for BCL2 apoptosis regulator (Bcl2) and purinergic receptor P2Y12 (P2yr12) in the HPC, together with upregulated microRNA(miR)-146a-5p in the PFC, prevailed in 9-month-old animals. miR-155 positively correlated with miR-146a and miR-21 in the PFC, and miR-125b positively correlated with miR-155, miR-21, while miR-146a in the HPC. Correlations between genes and miRNAs were dynamic, varying by genotype, region, and age, suggesting an intricate, disease-modulated interaction between miRNAs and target pathways. These findings contribute to our understanding of miRNAs as therapeutic targets for AD, given their multifaceted effects on neurons and glial cells.

2024Journal article

Open access

Targeting cyclin-dependent kinases/ phosphoinositide-3- phosphate for metastatic breast cancer treatment: pre-clinical studies

Publication . Rodrigues, Carolina Adelaide Major; Brito, Maria Alexandra de Oliveira Silva Braga Pedreira de; Herrera Garcia, Federico

Atualmente, o cancro da mama (CM) é um dos principais responsáveis pelo aumento do número de casos de doença oncológica, sendo a neoplasia mais diagnosticada e a principal causa de mortalidade feminina. Apesar dos avanços na taxa de sobrevivência dos pacientes com CM, o surgimento de metástases leva ao seu declínio. Exacerbando a situação, cerca de 30% dos pacientes com CM metastático desenvolvem metástases encefálicas (ME), uma condição incurável e associada a um prognóstico severo. Este prognóstico deve-se, sobretudo, à permeabilidade seletiva que a barreira hematoencefálica (BHE) apresenta, dificultando o tratamento de pacientes nesta condição. Entre os subtipos de CM, o triplo-negativo não só é um dos mais agressivos, como também é dos que apresenta uma maior incidência de ME. Estes factos, aliados à escassez de opções terapêuticas oriundas do desconhecimento de alvos moleculares específicos para este subtipo, determina o prognóstico severo e enfatiza a urgência do desenvolvimento de novas terâpeuticas. Neste sentido, modular alterações moleculares e vias de sinalização que as células tumorais exploram para a progressão do cancro é crucial para o desenvolvimento de terapias direcionadas. Vias como a ciclina D1-cinases dependentes de ciclina (CDK) 4/6 e a fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K)/proteína cinase B (AKT)/alvo da rapamacina em mamíferos (mTOR), que promovem a progressão do CM, constituem potenciais alvos terapêuticos particularmente relevantes para o CM triplo-negativo, que apresenta alterações a elas associadas. Neste âmbito, estudos prévios realizados no nosso laboratório identificaram um inibidor promissor de ambas as vias ciclina D1-CDK4/6 e PI3K/AKT/mTOR, pelo que o objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da sua eficácia e segurança em modelos pré-clínicos distintos: um modelo esferóide tumoral tridimensional (3D) in vitro com células de adenocarcinoma humano triplo-negativo (MDA-MB-231- Br4), o qual foi também combinado num modelo da BHE in vitro, assim como um modelo in vivo que recorre à inoculação de células de CM triplo-negativo de murino (4T1) para o desenvolvimento de ME. Por conter várias camadas com comportamentos distintos, o modelo esferóide mimetiza a complexidade tumoral e confere uma resistência terapêutica análoga à observada em respostas humanas. Por outro lado, o modelo murino escolhido para o estudo de ME do CM (MECM) facilita o desenvolvimento de metástases experimentais ao replicar com precisão a formação e a localização das MECM em locais típicos, como o hipocampo. Logo, ambos os modelos têm grande potencial para simular ME, justificando sua escolha para os estudos pré-clínicos realizados. Para o nosso trabalho começámos por estabelecer e caracterizar um modelo tumoral 3D de MECM usando as células MDA-MB-231-Br4, uma linha celular com propensão para a metastização no encéfalo. Para a monitorização diária do diâmetro e da morfologia dos esferóides foi utilizado um microscópio de fluorescência widefield, enquanto que para a monitorização da função metabólica foi medida a intensidade de fluorescência após o ensaio da resazurina. Foram testadas três densidades celulares (1000, 2000 e 5000 células/poço), para as quais se observou um crescimento dos esferóides até o quarto dia, seguido de um declínio após o sexto em cultura. A atividade metabólica dos esferóides mostrou-se crescente até ao oitavo dia, independentemente da densidade celular, sugerindo uma viabilidade sustentada. Os resultados mais promissores foram observados para a densidade de 2000 células/poço, onde as alterações morfológicas foram menos drásticas comparativamente, proporcionando melhor reprodutibilidade. O terceiro dia foi escolhido como ideal para os estudos, pois a integridade estrutural e viabilidade foram mantidas até ao quarto dia permitiriam ensaios de 24 horas (tempo escolhido para ensaios in vitro) em condições ótimas. Visando avaliar a ação do inibidor duplo previamente identificado, 10 μM deste foram aplicados em esferóides formados (com três dias, ponto ótimo) durante 24 horas e foram avaliadas as alterações estruturais e na expressão das proteínas alvo por imunocitoquímica. Usando um microscópio de fluorescência widefield, verificou-se que tanto os esferóides não tratados, como os tratados com abemaciclib (controlo positivo, inibidor CK4/6 permeável à BHE) preservaram a sua integridade estrutural, enquanto os tratados com o inibidor duplo apresentaram um índice de deformação acentuado (p<0.01). Por sua vez, a avaliação da expressão proteica através de microscopia confocal permitiu inferir que o inibidor reduz eficazmente a proliferação celular (expressão do Ki-67, p<0.001), ao contrário do abemaciclib. A redução na expressão da CDK4 (p<0.001) também foi evidente, mas o inibidor não teve efeito significativo na expressão da ciclina D1 e da CDK6, enquanto o abemaciclib provocou o seu aumento (p<0.001). Para complementar esta última avaliação, repetimos a análise com uma concentração mais elevada do inibidor (100 μM), para estudar o seu efeito na expressão das proteínas que se mantiveram inalteradas com a concentração inicialmente usada (10 µM). Observou-se que uma maior dose de inibidor aumentou a expressão da ciclina D1, embora sem significância, contrariamente ao abemaciclib, que manteve o seu aumento significativo (p<0.001). Curiosamente, houve um ligeiro aumento da expressão da CDK6 (p<0.001) por parte do inibidor duplo, enquanto o abemaciclib diminuiu acentuadamente a sua expressão (p<0.001). Estes resultados sugerem que o inibidor duplo poderá ter afinidade superior pela CDK4 em relação à CDK6, à semelhança do controlo positivo, o que explicaria a redução significativa na expressão de CDK4 com menores doses de fármaco e a mínima variação na expressão do CDK6. Dado que este trabalho visava o tratamento das MECM, avaliámos a segurança do inibidor para as células do endotélio cerebral, assim como a sua eficácia com o endotélio da BHE. Para tal, foi utilizado um modelo robusto da BHE in vitro em que células endoteliais humanas da microvasculatura cerebral (HBMECs) são cultivadas sobre membranas semi-permeáveis (transwells), colocados em poços de caixas de cultura, definindo um compartimento superior (que mimetiza o compartimento sanguíneo) e um inferior (que mimetiza o encéfalo), onde são colocados os esferóides. Após a aplicação de 100 μM de inibidor (maior concentração testada), foram medidas a resistência elétrica transendotelial e a permeabilidade paracelular das monocamadas endoteliais, não se tendo observado alterações significativas em ambos os parâmetros de integridade, confirmando a segurança do fármaco para as HBMECs. Adicionalmente, a eficácia do inibidor nos esferóides foi avaliada por imunocitoquímica e microscopia confocal, confirmando novamente a redução da proliferação celular (Ki-67, p<0.001) e da expressão da CDK4. Houve também uma redução da expressão da ciclina D1 (p<0.001), enquanto a CDK6 aumentou com o inibidor duplo (p<0.001), possivelmente por mecanismos compensatórios. Dado os resultados promissores obtidos in vitro, com células humanas, projetou-se avançar para estudos in vivo como prova de conceito. Começou por se assegurar a atividade do inibidor em células murinas (4T1) usadas no modelo in vivo, recorrendo à análise imunocitoquímica da proliferação celular. Observou-se uma redução significativa na expressão de Ki-67 (p<0.001), semelhante aos resultados com células humanas em culturas simples, o que nos permitiu avançar. O modelo murino da patologia foi estabelecido através da inoculação de células 4T1 na artéria carótida comum de ratinhos imunocompetentes, promovendo o desenvolvimento de ME. Sete dias após a injeção, quando já existem metástases bem estabelecidas, os animais foram tratados durante quatro dias por gavagem oral com 100 mg/kg de inibidor duplo ou de abemaciclib. Em contrapartida, o grupo de controlo negativo recebeu apenas o veículo e os animais foram sacrificados ao 11º dia. Para avaliar a extensão das ME após o tratamento, realizou-se uma coloração de hematoxilina-eosina (HE) em secções coronais do hipocampo cranial, onde as metástases são mais frequentes. A análise das secções revelou uma redução da carga tumoral e do número de metástases em animais tratados com ambos os inibidores, mas sem significância estatística. No entanto, o inibidor duplo reduziu significativamente estes dois parâmetros especificamente na região do hipocampo (p<0.05) comparativamente aos grupos de controlo. Adicionalmente, foi realizada a avaliação histológica nos pulmões que revelou um redução na carga tumoral e no número de metástases por parte do inibidor duplo, ainda que sem significância. Assim, os resultados histológicos evidenciam a eficácia do inibidor duplo em diferentes regiões e a sua permeabilidade à BHE. Seguidamente, efetuámos uma caracterização molecular do efeito do tratamento na proliferação e na progressão do ciclo celular das ME via imunohistoquímica, examinando as mesmas proteínas dos ensaios 3D. Verificou-se uma semelhança na ação sobre o Ki-67, a CDK4 e a ciclina D1, cuja expressão foi eficazmente reduzida (p<0.001). Em oposição ao in vitro, a CDK6 foi mais suprimida com o inibidor duplo do que com o abemaciclib (p<0.001), possivelmente devido aos diferentes regimes de tratamento. Contudo, ambos acentuam a ação antitumoral do inibidor duplo e seu efeito sobre a via da ciclina D1-CDK4/6. Avaliou-se ainda a segurança do inibidor aplicando o esquema de tratamento usado anteriormente (100 mg/kg de cada um dos inibidores por gavagem oral durante 4 dias e veículo para o grupo de controlo) em animais saudáveis. As análises bioquímicas plasmáticas não revelaram alterações nos vários marcadores bioquímicos avaliados (creatinina cinase, ureia e alanina aminotransferase), tal como os exames histológicos não revelaram toxicidade ou danos estruturais nos órgãos periféricos (pulmões, fígado, rins e coração), confirmando a segurança do inibidor duplo para o tratamento do CM triplo-negativo metastático. No seu conjunto, este trabalho lança as bases para uma abordagem terapêutica pioneira para pacientes com CM triplo-negativo metastático, principalmente aqueles afetados por ME, reduzindo a letalidade e melhorando o seu bem-estar.

2024Master thesis

Embargoed access

Antibiotic-lipid based nanosystem as a tool to specifically target Staphylococcus aureus biofilms

Publication . Ferreira, M.C. Magda Sofia Catroga Ferreira; Aguiar, Sandra Isabel Rodrigues de; Gaspar, Maria Manuela de Jesus Guilherme; Bettencourt, Ana Francisca de Campos Simão

Abstract - Hospital acquired infections (HAIs) is one of the leading causes of death worldwide, with Staphylococcus aureus being among the most prevalent microorganisms implicated in these infections. The ability of S. aureus to form biofilms and evade the immune system, along with the emergence of multidrug-resistant strains (MDR), exacerbates the complexity of eradicating infections. Conventional therapies characterized by prolonged antibiotic regiments have a poor rate of success, mainly due to the reduced penetration of antibiotics through the biofilms and low accumulation levels at infected sites. The ineffectiveness of current treatments has stimulated extensive research into the development of innovative therapeutic approaches. To address this need, the aim of this thesis was the development of a nanosystem by incorporating an antibiotic into liposomes, taking advantage of the unique benefits offered by these nanotechnological platforms. For this purpose, we first explored the antibacterial activity of three common antibiotics in clinical use – levofloxacin (LEV), vancomycin (VCM) and rifabutin (RFB) – against a reference strain of S. aureus (ATCC®25923™) in both planktonic and biofilm states. Subsequently, the antibiotics were incorporated into liposomes with different lipid compositions, and their incorporations parameters were assessed. Free RFB displayed the most potent antibacterial effect with MIC and MBIC50 below 0.006 µg/mL, along with the highest antibiotic loading capacity when nanoformulated, preserving its antibacterial activity. Based on these results, RFB was selected for further in vitro studies and the influence of the different lipid compositions on bacterial biofilm interactions was assessed, using a biofilm transwell model and confocal scanning laser microscopy analysis. It was observed that the positively charged RFB liposomes (LIP3) exhibited the highest interaction with biofilms. Nevertheless, RFB incorporated in negatively charged liposomes with fusogenic properties (LIP1) displayed lower MBIC50 values. Preliminary safety assessment of RFB formulations towards osteoblast and fibroblast cell lines indicated that a reduction in cell viability was only observed for the LIP3. Taking this into account, LIP1 was selected to move forward. Following these findings, the potential of free RFB was validated in a collection of S. aureus clinical isolates to provide a more accurate reflection of the challenges faced in real-world settings, in both planktonic (n=114) and biofilm (n=40) states. Additionally, the antibacterial activity of RFB incorporated in our developed liposome (LIP1) was validated against a set of clinical isolates (n=40) in both states. In conclusion, all the work developed contributed to the pursuit of effective therapeutic strategies for planktonic and biofilm-associated S. aureus infections, by exploring the potential of antibiotic repurposing and incorporating them into liposomes

2024-09-18Doctoral thesis

Open access