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Evidence for the dissemination to humans of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus ST398 through the pork production chain : a study in a portuguese slaughterhouse

Publication . Bouchami, Ons; Fraqueza, M. J.; Faria, Nuno Alexandre; Alves, Valquíria; Lawal, Opeyemi Uwangbaoje; Lencastre, Herminia de; Miragaia, Maria

Livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (LA-MRSA) ST398 was recovered from infections in humans exposed to animals, raising public health concerns. However, contact with food producing chain as a means of transmission of LA-MRSA to humans remains poorly understood. We aimed to assess if pork production chain is a source of MRSA ST398 for human colonization and infection. MRSA from live pigs, meat, the environment, and slaughterhouse workers were analyzed by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE), spa, MLST typing, SNPs and for antibiotic resistance and virulence gene profiles. We compared core and accessory genomes of MRSA ST398 isolated from slaughterhouse and hospital. We detected MRSA ST398 (t011, t108, t1451) along the entire pork production chain (live pigs: 60%; equipment: 38%; meat: 23%) and in workers (40%). All MRSA ST398 were multidrug resistant, and the majority carried genes encoding biocide resistance and enterotoxins. We found 23 cross-transmission events between live pigs, meat, and workers (6–55 SNPs). MRSA ST398 from infection and slaughterhouse environment belonged to the same clonal type (ST398, t011, SCCmec V), but differed in 321–378 SNPs. Pork production chain can be a source of MRSA ST398 for colonization of human slaughterhouse workers, which can represent a risk of subsequent meat contamination and human infection.

2020-11-29Journal article

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Distinct phenotypic and genomic signatures underlie contrasting pathogenic potential of Staphylococcus epidermidis clonal lineages

Publication . Espadinha, Diana; Sobral, Rita G.; Mendes, Catarina Inês; Méric, Guillaume; Sheppard, Samuel K.; Carrico, Joao Andre; de Lencastre, Hermínia; Miragaia, Maria

Background: Staphylococcus epidermidis is a common skin commensal that has emerged as a pathogen in hospitals, mainly related to medical devices-associated infections. Noteworthy, infection rates by S. epidermidis have the tendency to rise steeply in next decades together with medical devices use and immunocompromized population growth. Staphylococcus epidermidis population structure includes two major clonal lineages (A/C and B) that present contrasting pathogenic potentials. To address this distinction and explore the basis of increased pathogenicity of A/C lineage, we performed a detailed comparative analysis using phylogenetic and integrated pangenome-wide-association study (panGWAS) approaches and compared the lineages's phenotypes in in vitro conditions mimicking carriage and infection. Results: Each S. epidermidis lineage had distinct phenotypic signatures in skin and infection conditions and differed in genomic content. Combination of phenotypic and genotypic data revealed that both lineages were well adapted to skin environmental cues. However, they appear to occupy different skin niches, perform distinct biological functions in the skin and use different mechanisms to complete the same function: lineage B strains showed evidence of specialization to survival in microaerobic and lipid rich environment, characteristic of hair follicle and sebaceous glands; lineage A/C strains showed evidence for adaption to diverse osmotic and pH conditions, potentially allowing them to occupy a broader and more superficial skin niche. In infection conditions, A/C strains had an advantage, having the potential to bind blood-associated host matrix proteins, form biofilms at blood pH, resist antibiotics and macrophage acidity and to produce proteases. These features were observed to be rare in the lineage B strains. PanGWAS analysis produced a catalog of putative S. epidermidis virulence factors and identified an epidemiological molecular marker for the more pathogenic lineage. Conclusion: The prevalence of A/C lineage in infection is probably related to a higher metabolic and genomic versatility that allows rapid adaptation during transition from a commensal to a pathogenic lifestyle. The putative virulence and phenotypic factors associated to A/C lineage constitute a reliable framework for future studies on S. epidermidis pathogenesis and the finding of an epidemiological marker for the more pathogenic lineage is an asset for the management of S. epidermidis infections.

2019Journal article

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Cation-mediated gelation of the fucose-rich polysaccharide FucoPol: preparation and characterization of hydrogel beads and their cytotoxicity assessment

Publication . Fialho, Letícia; Araújo, Diana; Delgado Alves, Vitor; Roma-Rodrigues, Catarina; Baptista, Pedro V.; Fernandes, Alexandra R.; Freitas, Filomena; Reis, Maria A.M.

This study describes for the first time the iron- and copper-mediated gelation of FucoPol, fucoserich bacterial polysaccharide. The ability of FucoPol to gel in the presence of metal cations, including iron(III) and copper(II), was used for the preparation of hydrogel beads. Iron mediated the formation of stable and not cytotoxic gel beads, while copper resulted in fragile and cytotoxic ones. Copper-mediated beads coated with an iron-mediated gel layer were more stable and had reduced cytotoxicity. The resulting polymeric structures had differing morphology, physical properties and cytotoxicity, which support their use in several applications, including biomedicine, agriculture and bioremediation

2021Journal article

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Staphylococcus saprophyticus causing infections in humans is associated with high resistance to heavy metals

Publication . Lawal, Opeyemi U.; Fraqueza, M. J.; Worning, Peder; Bouchami, Ons

Staphylococcus saprophyticus is a common pathogen of the urinary tract, a heavy metal-rich environment, but information regarding its heavy metal resistance is unknown. We investigated 422 S. saprophyticus isolates from human infection and colonization/contamination, animals, and environmental sources for resistance to copper, zinc, arsenic, and cadmium using the agar dilution method. To identify the genes associated with metal resistance and assess possible links to pathogenicity, we accessed the wholegenome sequence of all isolates and used in silico and pangenome-wide association approaches. The MIC values for copper and zinc were uniformly high (1,600mg/liter). Genes encoding copper efflux pumps (copA, copB, copZ, mco, and csoR) and zinc transporters (zinT, czrAB, znuBC, and zur) were abundant in the population (20 to 100%). Arsenic and cadmium showed various susceptibility levels. Genes encoding the ars operon (arsRDABC), an ABC transporter and a two-component permease, were linked to resistance to arsenic (MICs$ 1,600mg/liter; 14% [58/422]; P, 0.05). At least three cad genes (cadA or cadC and cadD-cadX or czrC) and genes encoding multidrug efflux pumps and hyperosmoregulation in acidified conditions were associated with resistance to cadmium (MICs$ 200mg/liter; 20% [85/422]; P, 0.05). These resistance genes were frequently carried by mobile genetic elements. Resistance to arsenic and cadmium were linked to human infection and a clonal lineage originating in animals (P, 0.05). Altogether, S. saprophyticus was highly resistant to heavy metals and accumulated multiple metal resistance determinants. The highest arsenic and cadmium resistance levels were associated with infection, suggesting resistance to these metals is relevant for S. saprophyticus pathogenicity

2021-06-17Journal article

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Investigating cellular and molecular neuroendocrine signalling in the diabetic gut

Publication . Mira, Miguel Ângelo de Freitas; Mollet, Inês Maria de Stoop Camões Teixeira Guerra; Carvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-

A glucose é um dos monossacarídeos mais importantes para a vida, uma vez que o nosso organismo a utiliza como uma fonte de energia indispensável ao funcionamento normal dos vários órgãos e tecidos que dela precisam. Para que esse uso aconteça, é necessário que a glucose passe da corrente sanguínea para o interior das células, sendo que esse transporte é possível graças a uma substância química concebida pelo organismo: a insulina. A insulina é uma hormona produzida pelas células β pancreáticas das ilhotas de Langerhans que é libertada das mesmas quando os níveis de “açúcar” na corrente sanguínea se encontram elevados. Contudo, na diabetes mellitus (DM), esta situação está alterada. A DM é uma doença crónica caracterizada pelo aumento desregulado dos níveis de glucose no sangue, fenómeno designado por hiperglicemia, e pela incapacidade do organismo em transportar toda a glucose proveniente dos alimentos, levando a um desequilíbrio nos seus níveis sanguíneos. Nos últimos dez anos, o impacto do envelhecimento da estrutura etária da população portuguesa (20-79 anos) levou a um aumento de cerca de dois pontos percentuais na taxa de prevalência da DM entre 2009 e 2018, o que equivale a um crescimento de cerca de 16,3%. Mundialmente, em 2019, 463 milhões de pessoas tinham DM (9,3% da população até à data), sendo que 134 milhões se encontravam entre os 65 e os 99 anos (19,4% da população contida nessa faixa etária). Em Portugal, a prevalência nessa faixa etária fixava-se nos 24%. Estima-se que essas prevalências cresçam a um ritmo alarmante, o que leva a que a DM seja considerada uma grande ameaça mundial para a saúde pública. O tipo mais comum de DM, a DM tipo 2 (T2DM), que ocorre em cerca de 90% da população mundial com DM, e cuja prevalência é mais elevada em indivíduos mais envelhecidos, resulta, numa fase inicial (pré-diabetes), de uma anomalia nos níveis de glucose em jejum e de uma intolerância a este carbohidrato. Após vários anos, as células do nosso organismo ficam incapazes de responder de forma correta à insulina, induzindo-se uma resistência a esta hormona que levará a um aumento nos seus níveis de produção, e eventualmente, à incapacidade das células β em compensar este desequilíbrio. Tudo isto provocará a ocorrência de complicações macrovasculares, tais como doença coronária e hipertensão arterial, e microvasculares, nomeadamente retinopatia e neuropatia, que podem causar complicações severas que diminuirão drasticamente a qualidade e esperança média de vida dos indivíduos com T2DM. Os tipos de cirurgia bariátrica são divididos em três grupos: 1) os principalmente restritivos, que incluem a banda gástrica ajustável e a gastrectomia vertical, e que diminuem a quantidade de alimentos ingeridos por diminuição do volume gástrico, 2) os principalmente disabsortivos, como a derivação biliopancreática e o duodenal switch, em que a perda de peso é altamente eficaz, uma vez que reduzem o trajeto no qual os nutrientes vão ser absorvidos, e 3) os que usam uma combinação de ambas as técnicas, também designados por procedimentos mistos, como é o caso do bypass gástrico em Y de Roux (RYGB). No RYGB, é criada uma pequena bolsa gástrica com cerca de trinta mililitros de capacidade que é ligada ao intestino delgado ao nível do jejuno, pelo que as regiões do intestino delgado proximal (i.e., duodeno e início do jejuno) nunca sofreriam a ação das secreções pancreática e biliar. Contudo, e completamente por acaso, a regressão da T2DM que se observou dias após este bypass gástrico colocam em evidência o intestino delgado proximal como um dos principais intervenientes da etiologia desta doença. Modificações dos níveis hormonais, principalmente ao nível do péptido semelhante ao glucagão 1 (GLP-1), e do microbioma intestinal têm sido estudadas para explicar esta regressão, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem inconclusivos. Em condições normais, os processos de sinalização ao nível da parede intestinal que ocorrem em resposta a certos nutrientes ingeridos envolvem enterócitos, células enteroendócrinas (EEC’s), e uma rede de glias entéricas, nervos intrínsecos e extrínsecos que comunicam com o sistema nervoso central (CNS) e com o periférico. Para que haja propagação do sinal, é necessário que um neurónio pré-sináptico seja capaz de gerar e propagar um potencial de ação através do seu axónio, transmitindo-o por uma sinapse mediante a libertação de neurotransmissores. Esses neurotransmissores irão potenciar uma reação num neurónio pós-sináptico ou numa célula efetora, tais como as células musculares e a maioria das células exócrinas e endócrinas. Ao nível do CNS dos mamíferos em desenvolvimento, o principal neurotransmissor inibitório corresponde ao ácido γ-aminobutírico [nome IUPAC: ácido 4-aminobutanoico (GABA)], neurotransmissor esse que se encontra presente nos nervos entéricos e em EEC’s intestinais. Como tal, a neurotransmissão mediada pelo GABA considera-se envolvida 1) na regulação das funções fisiológicas ao nível do trato gastrointestinal, e 2) como sendo um mediador enteroendócrino que influencia a função desse trato. O GABA exerce a sua função através da ligação aos respetivos recetores, podendo os mesmos ser classificados em ionotrópicos (GABAA) ou metabotrópicos (GABAB). Dos dois, a informação relacionada com o recetor GABAB (GABABR) é a mais escassa, visto que 1) estes recetores foram dos últimos a ser caracterizados a nível molecular, e 2) apenas dois derivados agonísticos do GABA, baclofeno e ácido γ-hidroxibutirato, são capazes de se ligar ao lado ortostático da estrutura deste recetor. Contudo, os seus efeitos secundários, tais como dormência e tonturas, levam a que a administração destes derivados seja desfavorável em muitos casos de patologia. A nível molecular, os GABABRs consistem em duas subunidades, GABABR1 e GABABR2, sendo que o GABABR2 é também importante para o acoplamento das proteínas G, cuja sinalização é regulada por homo-oligómeros de subunidades auxiliares, aos quais se dá o nome de domínios de tetramerização dos canais de potássio (KCTD’s). KCTD8, KCTD12 e KCTD16 pertencem ao clado F de uma grande família de vinte e cinco proteínas humanas KCTD que atuam especificamente com os GABABR, regulando vias intracelulares a jusante via o acoplamento a proteínas G, nomeadamente os canais de iões cálcio dependentes de voltagem, os canais de iões potássio, e o adenilato ciclase. Mais concretamente, as proteínas KCTD interagem com um resíduo de tirosina-902 presente no terminal-C do domínio intracelular da subunidade GABABR2. No entanto, a distribuição do GABABR2 com estas proteínas específicas ao nível do duodeno e do início do jejuno, assim como o possível papel dessa interação no envelhecimento ou na progressão da T2DM, ainda são desconhecidas. Neste estudo, procedeu-se à extração do intestino delgado proximal proveniente de murganhos masculinos C57BL/6J que foram usados como modelos de envelhecimento e de pré-diabetes induzida por uma dieta rica em gordura (HFD). Esta região intestinal foi estudada sob a forma de secções do duodeno ou de rolinhos intestinais, secções essas que foram analisadas mediante dois ensaios imuno-histoquímicos: ligação por proximidade (PLA) e imunofluorescência (IF), que permitiram investigar a co-localização das proteínas KCTD com a subunidade GABABR2, e apenas IF, para analisar os níveis de expressão dos KCTD ao nível das células não gliais (presumivelmente neurais) e gliais marcadas com a proteína ácida fibrilar glial (GFAP), um dos melhores marcadores para simbolizar a ativação da glia entérica após situações de danos estruturais ou de stress ao nível do sistema nervoso entérico. Estas análises imuno-histoquímicas foram efetuadas na porção interior das vilosidades intestinais, à qual se dá o nome de lâmina própria. Os resultados obtidos por PLA e por IF demonstraram que, nos murganhos HFD, a expressão das proteínas KCTD8 e KCTD16 co-localizadas com o GABABR2 decresceu na ordem das 0.4 e 0.6 vezes respetivamente, quando comparada com os murganhos alimentados com uma dieta normal (NCD). No entanto, nos murganhos envelhecidos (20 meses de idade), todos os KCTD co-localizados com esta subunidade sofreram um aumento de cerca de 1.0 a 2.5 vezes na sua expressão, quando comparada com os murganhos jovens (4 meses). Estes resultados indicam que a sinalização potenciada pelo GABABR e dependente do KCTD8 e do KCTD16 sofre uma disrupção independente da idade em casos de pré-diabetes. Os estudos de IF revelaram que as células gliais que não expressam as proteínas KCTD sofreram um aumento geral da sua expressão em todos os murganhos, o que é indicativo de uma maior inflamação intestinal com a idade e com a pré-diabetes. Nas células não gliais (presumivelmente células neurais), observou-se um aumento de 50 vezes na expressão do KCTD12 ao nível dos murganhos HFD, e um decréscimo de 0.7 vezes para o KCTD16 nos murganhos envelhecidos. Finalmente, a expressão de todos os KCTD estudados ao nível das células gliais aumentou em todos os murganhos envelhecidos, mas decresceu 0.6 vezes para o KCTD16 nos murganhos HFD. A partir destes resultados, podemos inferir que a sinalização mediada pelo GABABR ao nível do intestino delgado proximal sofreu uma disrupção independente da idade ao nível dos modelos pré-diabéticos, sendo que a glia entérica, quando co-localizada com o KCTD16 (decréscimo nos seus níveis), pode estar envolvida nessa disrupção. Para além disso, o KCTD12 em células não gliais, pelo facto de apresentar uma expressão aumentada significativamente em condições pré-diabéticas, pode ser considerado, juntamente com o KCTD16, como um potencial alvo farmacológico para estudar a prevenção desta doença crónica.

2021Master thesis

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