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Behind Brain Metastases Formation: Cellular and Molecular Alterations and Blood Brain Barrier Disruption

Publication . Pereira, Joana; Garcia, Ana Rita; Figueira, Inês; Malhó, Rui; Brito, Maria Alexandra

Breast cancer (BC) brain metastases is a life-threatening condition to which accounts the poor understanding of BC cells’ (BCCs) extravasation into the brain, precluding the development of preventive strategies. Thus, we aimed to unravel the players involved in the interaction between BCCs and blood–brain barrier (BBB) endothelial cells underlying BBB alterations and the transendothelial migration of malignant cells. We used brain microvascular endothelial cells (BMECs) as a BBB in vitro model, under conditions mimicking shear stress to improve in vivo-like BBB features. Mixed cultures were performed by the addition of fluorescently labelled BCCs to distinguish individual cell populations. BCC–BMEC interaction compromised BBB integrity, as revealed by junctional proteins (β-catenin and zonula occludens-1) disruption and caveolae (caveolin-1) increase, reflecting paracellular and transcellular hyperpermeability, respectively. Both BMECs and BCCs presented alterations in the expression pattern of connexin 43, suggesting the involvement of the gap junction protein. Myosin light chain kinase and phosphorylated myosin light chain were upregulated, revealing the involvement of the endothelial cytoskeleton in the extravasation process. β4-Integrin and focal adhesion kinase were colocalised in malignant cells, reflecting molecular interaction. Moreover, BCCs exhibited invadopodia, attesting migratory properties. Collectively, hub players involved in BC brain metastases formation were unveiled, disclosing possible therapeutic targets for metastases prevention.

2021-06-30Journal article

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The blood-brain barrier in brain metastasization of breast cancer : a source of biomarkers, a target for modulation, and an obstacle to overcome

Publication . Pereira, Joana; Brito, Maria Alexandra de Oliveira Silva Braga Pedreira de; Videira, Mafalda de Castro Ascensão Marques; Carvalheiro, Manuela Colla

As of 2020, breast cancer (BC) has become the leading cause of neoplastic disease worldwide, with an estimated 3 million new cases, and projections indicate that it will result in 1 million fatalities by 2040. An alarming concern of this disease is its metastatic stage, responsible for most BC deaths. Among all BC subtypes, triple-negative BC (TNBC) stands out as the most aggressive with a poor prognosis. It is also particularly susceptible to developing brain metastases. BC brain metastases (BCBM) leave patients with limited treatment options and extremely low survival rates, due to lack of a timely diagnose owing to the absence of biomarkers, while blood-brain barrier (BBB) restricts most drugs’ brain access. Thus, it is crucial to understand the mechanism involved in the interaction between BBB endothelial cells and breast cancer cells (BCCs) prior to brain metastases formation, as well as the identification of early biomarkers of this process. Additionally, new therapeutics addressing BCCs extravasation process and eradicate BCBM should be investigated. This thesis stands out due to its multifaceted approach, which includes the 1) investigation of the key molecules involved in the interaction between BBB endothelial cells and BCCs during BCBM development; 2) identification of circulating biomarkers indicative of BCBM development, with potential diagnostic and prognostic value, utilizing liquid biopsy; 3) uncover molecules capable of preserving the BBB during extravasation, aiming to impede the transendothelial migration (TEM) of BCCs as a preventive measure; 4) and explore novel treatment strategies, such as the co-administration of a cytotoxic drug and a small interfering RNA (siRNA) to abrogate the already established BCBM. Firstly, the players involved in TNBC cells (4T1 cell line) extravasation, as well as its temporal and spatial profile were disclosed in vivo and in vitro. Key mechanisms such as paracellular and transcellular BBB permeability, cell communication, cytoskeleton remodelling, proliferative and migratory BCC´s properties accompanied with invadopodium formation were revealed. Moreover, brain microvascular endotelial-derived extracellular vesicles and specific microRNAs (miR) were identified as biomarkers of advanced and precocious stages of BCBM, respectively. Secondly, given the altered BBB permeability upon BCCs contact, a preventive strategy was explored aiming the improvement of BBB’ properties. A high-throughput microscopy screening was performed on a library of new and already approved drugs to assess their ability to preserve BBB properties and prevent BCCs from adhering and migrating across the endothelium. Among the tested drugs, minocycline hydrochloride (MH) was the most promising in preventing BBB disruption and 4T1 cells migration, thus rising as a potential modulator of BBB integrity preservation. To minimize side effects and ensure specific BBB-delivery, a trojan horse drug carrier approach was employed targeting the transferrin receptor (TfR), which is highly expressed in brain microvascular endothelial cells, using the RI7217 (Ri7), an anti-TfR antibody. A transferrin receptor-targeted liposome (Lip) carrying MH (Ri7-MH-Lip) was developed and characterized. Ri7-MH-Lip disclosed increased cellular uptake via clathrin-dependent pathway, with no endothelial safety concerns. The Ri7-MH-Lip treatment not only reduced in vitro BCC-induced junctional protein disruption but also decreased endothelial matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) overexpression. Additionally, it hampered BCCs’ adhesion to the endothelial monolayer via downregulation of endothelial vascular cell adhesion molecule 1. Ri7-MH-Lip also showed a safe and efficient outcome in vivo. No alteration in the enzymes associated with cardiac, renal, and hepatic toxicity was observed. Moreover, a reduction in BCBM was demonstrated, with the decrease of paracellular permeability and immune-cell infiltration. Furthermore, modulation of circulant miR-802-5p and miR-194-5p expression revealed their potential to be used as biomarkers of therapeutic response. Finally, given the persistent expression of platelet-derived growth factor subunit B (PDGF-B) in BCCs during the formation of brain metastases, coupled with the absence of specific therapies for this pathology, there is a pressing need for new therapeutic strategies. This thesis unveiled the potential of a BBB-permeant dual therapeutic strategy for the delivery of a cytotoxic molecule [salinomycin - SAL] and siRNA therapy [anti-PDGF-B - siPDGF-B] to induce BCBM eradication. Stable nucleic acid lipid particle (SNALP) for encapsulating siPDGF-B, as well as liposomes for incorporating SAL were developed and characterized. Both were conjugated with chlorotoxin (CTX) for to specifically target BCCs. The resulting formulations are denoted as CTX-siPDGF-B-SNALP and CTX-SAL-Lip, respectively. The co-administration of these systems in vitro inhibited BCCs’ proliferation (Ki-67) while the application of each formulation individually led to cell senescence in both cases. The formulations did not affect endothelial viability, although SAL liposomes impaired BBB integrity. In vivo, treatment with siPDGF-B lipid particles effectively reduced both the number of metastases and the levels of PDGF-B and Ki-67. In conclusion, this study has unveiled the cellular and molecular processes involved in BCBM formation, it has also revealed how preventive and therapeutic strategies influence the pathological events associated with disease development. Notably, miR-802 and miR-194 have emerged as valuable diagnostic and prognostic biomarkers. While this study is merely the tip of the iceberg, it introduces exciting possibilities. It suggests repurposing MH as a preventive therapeutic approach and utilizing siPDGF-B as treatment. These findings pave the way for the development of personalized pharmacological strategies to combat this illness.

2024-07Doctoral thesis

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Dissecting miRNA-194-5p's and MEF2C's roles in breast cancer brain metastases

Publication . Caetano, Sara Cristina Barbosa; Brito, Maria Alexandra; Figueira, Inês

A nível global, o cancro mais diagnosticado em mulheres é o cancro da mama, tendo uma incidência de 2,3 milhões de novos casos por ano, o que levou à sua classificação como uma das principais causas de morte relacionada com o cancro. De entre os diversos subtipos de cancro da mama, o triplo negativo é considerado o subtipo mais agressivo, caracterizado por uma elevada propensão para desenvolver metástases, especialmente no parênquima encefálico. De facto, as metástases encefálicas de cancro da mama são um dos fatores que mais contribui para os elevados números de mortalidade em pacientes de cancro da mama, em muito devido à falta de terapias direcionadas e específicas para este subtipo. Durante o desenvolvimento de metástases, por um processo conhecido como a cascata metastática, as células tumorais sofrem alterações fenotípicas e morfológicas associadas sobretudo à ocorrência de um processo designado por transição epitelial-mesenquimal. Neste sentido, durante a transição epitelial-mesenquimal, as células tumorais perdem algumas das suas características epiteliais e adquirem um fenótipo parcial ou completamente mesenquimal, o que lhes confere propriedades de motilidade essenciais para processos invasivos que podem culminar na formação de metástases. No entanto, a complexidade que caracteriza a formação de metástases encefálicas de cancro da mama, especialmente derivadas do subtipo de cancro da mama triplo negativo, ainda é pouco compreendida. Por conseguinte, a descoberta de novas estratégias terapêuticas que consigam atuar na prevenção e mitigação das metástases de cancro da mama é necessária. Para tal, é imperativa a utilização de novos alvos passíveis de serem modulados e que visem prevenir ou atenuar o prognóstico associado à formação das metástases. Apesar das descobertas relativamente recentes no âmbito dos miRNAs e de proteínas oncogénicas, ainda há um longo caminho a percorrer para aumentar a sobrevivência global em pacientes com cancro da mama, especialmente aqueles que sofrem com a forma metastática de cancro da mama do subtipo triplo negativo. Estudos prévios realizados no nosso laboratório revelaram que o microRNA (miRNA ou miR)-194-5p está sub-expresso na corrente sanguínea numa fase inicial do desenvolvimento de metástases encefálicas de cancro da mama, o que aponta para que este miRNA possa ter um papel supressor no desenvolvimento de tumores. Através de uma análise bioinformática, foi também revelado que o fator de transcrição, conhecido como fator ativador do miócito 2C (MEF2C, do inglês myocyte enhancer factor 2C) é um alvo do miR-194-5p. Para além disso, a análise da expressão do MEF2C no parênquima encefálico, utilizando um modelo de ratinho da doença, demonstrou que este fator de transcrição tem uma expressão crescente ao longo do desenvolvimento de metástases encefálicas de cancro da mama. Adicionalmente, em amostras de pacientes com metástases encefálicas de cancro da mama, foi possível observar que com o aumento da severidade da doença, os níveis de MEF2C também incrementavam. Por estes motivos, tanto o miR-194-5p como o MEF2C surgem como novos intervenientes a serem estudados, com grande potencial para serem modulados e, desta forma, conseguir melhorar o prognóstico dos pacientes que sofrem de cancro da mama triplo negativo. Apesar da previsão in silico apontar para o MEF2C como um alvo do miR-194-5p, a causalidade entre a desregulação dos dois ainda não foi analisada até à data. Assim, este estudo pretende esclarecer o envolvimento tanto do MEF2C, tal como do miR-194-5p na tumorigénese, tentando estabelecer uma relação direta entre a sub-expressão deste miRNA e a sobre-expressão desta proteína. Adicionalmente, será determinante também perceber o papel do MEF2C e do miR-194-5p isoladamente nas propriedades metastáticas das células tumorais de cancro da mama. Uma linha celular de ratinho de cancro da mama triplo negativo (células 4T1) foi usada para as transfeções com um siRNA e um plasmídeo específicos para o MEF2C, ou com o pre-miR-194-5p, com o intuito de modular a expressão da proteína e do miRNA, respetivamente. As eficiências de modulação foram determinadas por real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) e por análise dos níveis de expressão do MEF2C e do miR-194-5p por imunofluorescência e por hibridização in situ, respetivamente. Em ambos os casos e após as modulações dos respetivos alvos, a viabilidade das células tumorais foi determinada pelo ensaio colorimétrico de MTT, enquanto as alterações fenotípicas das células foram avaliadas por imunofluorescência, analisando proteínas como a citoqueratina e a vimentina, marcadores epitelial e mesenquimal, respetivamente. Além disso, o comportamento migratório das células tumorais 4T1 foi seguido através da técnica de wound healing. Por último, o reflexo direto da modulação do miR-194-5p na expressão do MEF2C foi estudado recorrendo à análise dos níveis de mRNA e expressão proteica do MEF2C, através de RT-qPCR e análise de imunofluorescência respetivamente, ambos em células tumorais 4T1 a sobre-expressar o miR-194-5p. A modulação dos níveis de expressão do MEF2C foi conseguida com a transfeção de um siRNA e um plasmídeo, de forma a silenciar e sobre-expressar o MEF2C, respetivamente. O resultado do silenciamento do MEF2C foi confirmado pela redução significativa dos seus níveis de mRNA e da proteína. Apesar do aumento significativo dos níveis de mRNA do MEF2C, causado pelo plasmídeo, o mesmo não aconteceu com os seus níveis proteicos, uma vez que a eficiência de transfeção demonstrou ser consideravelmente baixa. Por esta razão, o plasmídeo usado para induzir a sobre-expressão do MEF2C foi excluído das restantes experiências em que se estudou o efeito desta proteína na tumorigénese das células de cancro da mama triplo negativo. Curiosamente, as células tumorais 4T1 que foram sujeitas ao silenciamento do MEF2C apresentaram uma diminuição na expressão tanto de vimentina como de citoqueratina, promovendo ainda uma perda significativa de capacidade migratória destas células. Por outro lado, o tratamento com o pre-miR-194-5p induziu um aumento dependente da dose na expressão do miRNA em células tumorais 4T1, embora com crescente toxicidade. Apesar da redução de viabilidade observada nas células tumorais tratadas com o pre-miR-194-5p a uma concentração de 30 nM, esta condição deverá ser estudada mais a fundo no futuro como uma possível opção terapêutica direcionada para as células tumorais de cancro da mama triplo negativo. A concentração não tóxica mais eficaz de pre-miR-194-5p (10 nM) foi selecionada e a sua expressão celular foi validada através de hibridização in situ, que mostrou novamente o aumento dos níveis celulares deste miR. Para além disso, a sobre-expressão do miR-194-5p promoveu ainda um aumento de citoqueratina e uma redução de vimentina, juntamente com uma diminuição significativa da capacidade migratória das células tumorais 4T1. Por fim, não foi possível estabelecer uma relação de causalidade entre o miR-194-5p e o MEF2C, uma vez que o aumento da expressão deste miR não induziu um efeito percetível nos níveis de mRNA nem proteicos do MEF2C. É importante realçar que com o intuito de perceber se o resultado anterior foi influenciado por algum mecanismo compensatório, foi feito um estudo adicional, a dois tempos diferentes (24 e 72 h). Ainda assim, não foi possível verificar a relação de causalidade entre o aumento da expressão do miR e o MEF2C. Coletivamente, os efeitos do silenciamento do MEF2C na expressão dos marcadores epitelial (citoqueratina) e mesenquimal (vimentina), juntamente com a redução da capacidade migratória das células tumorais 4T1, sugerem que o MEF2C tem um papel determinante nas propriedades invasoras das células tumorais, determinando a ocorrência parcial de transição epitelial-mesenquimal. De forma semelhante, a sobre-expressão do miR-194-5p também levou a uma redução da mobilidade das células tumorais 4T1, que, em conjunto com a mudança observada do fenótipo mesenquimal para o fenótipo epitelial, reflete um declínio no comportamento agressivo das células tumorais e reforça o papel do miR como supressor de tumores no cancro da mama triplo negativo. Em suma, ao perceber o contributo tanto do MEF2C como do miR-194-5p em cancro da mama triplo negativo, este estudo revela novos alvos passíveis de serem modulados em pacientes que sofrem deste subtipo de cancro da mama, de forma a tentar melhorar o seu prognóstico e, se possível, torná-lo livre de metástases.

2022-02-15Master thesis

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Circulating microRNAs as Biomarkers for Breast Cancer Brain Metastasis

Publication . Sereno, Marta Bruno Soares de Melo; Brito, Maria Alexandra; Videira, Mafalda

With the recent developments in the treatment of breast cancer (BC), that have improved prognosis of BC patients, metastatic disease is presently a major concern and the leading cause of death from BC. Particularly brain metastasis represent a serious oncologic problem, not only due to their high incidence in BC, poor prognosis and low survival but also because the brain microenvironment is considered a sanctuary for metastatic growth. While the blood brain barrier (BBB) restricts the entrance of most chemotherapeutics into the brain, brain cells can also contribute for tumor growth by exchanging factors with malignant cells. Altogether, this makes breast cancer brain metastases (BCBM) an uprising concern. Thus, the finding of reliable biomarkers that allow the early detection of BCBM, as well as new potential therapeutic targets, is in order. Recently, microRNAs (miRNAs or miR-) have arisen as powerful and specific biomarkers for different types of cancer and metastasis, having unique expression profiles depending not only on the type of cancer but also on the stage of the disease. Circulating miRNAs can be of special interest, due to their stability and easy quantification in biological fluids, allowing their usage in liquid biopsies for diagnosis and prognosis of oncologic diseases. Based on this, we hypothesized that miRNAs are aberrantly expressed in plasma prior to the detection of brain metastasis. So, the aim of this work was to identify miRNAs that could work as predictive biomarkers of BCBM in liquid biopsies. To this end, brain, lungs, kidneys, liver and plasma samples were collected from vehicle (control) and 4T1-injected female mice, at different timepoints during metastatic progression (5 hours, 3 days, 7 days and 10 days). Human samples of resected brain metastasis from triple negative BC patients were also studied. Analysis of brain and peripheral organs of the mouse model revealed that metastasis are particularly relevant in the brain, mainly in the hippocampus and that well established metastasis are only detectable from 7 days onwards. An initial miRNA screening by next generation sequencing (NGS) showed that plasma miRNAs are altered during brain metastasis development and that at 3 days, no metastasis were detected but a set of 8 miRNAs was deregulated. By real time PCR (RT-PCR), we could validate the downregulation of plasma miR-802-5p and miR-194-5p at three days and could see a trend for miR-92a-1-5p upregulation, and so, we propose that these miRNAs are potential biomarkers for the early detection of BCBM. Moreover, using bioinformatical tools, we predicted targets for these miRNAs, not only for a better understanding of the underlying mechanisms of these miRNAs but also to identify potential new targets for modulation. Matrix metalloproteinase-9 (MMP9) was a predicted target for miR-92a-1-5p. Immunofluorescence analysis of mouse brain sections revealed that MMP9 protein is expressed not only in malignant cells but also in the brain vasculature and in metastasis-associated vessels, pointing to a proangiogenic role of MMP9 Myocyte enhancer factor 2C (MEF2C) was predicted as a common target for both miR-802-5p and miR-194-5p. It was also observed that MEF2C is highly expressed in BCBM and that its expression increases with metastatic progression. Moreover, a nuclear translocation of MEF2C was observed in later stages of tumor progression, which indicates a higher activation of this transcription factor. Furthermore, MEF2C expression was detected in peritumoral astrocytes, pointing to a potential role of MEF2C in the cross-talk between astrocytes and malignant cells to promote tumor growth. High expression of MEF2C was further confirmed in human brain metastases from triple negative BC. In summary, this work revealed the potential in using circulating miRNAs as biomarkers for BCBM, pointing to miR-802-5p, miR-194-5p and miR-92a-1-5p as candidates to be used in liquid biopsies for the early detection of BCBM. It also revealed MEF2C as a new target for modulation and abrogation of BCBM.

2018-12-10Master thesis

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Blood-brain barrier: role in brain metastasization of breast cancer

Publication . Garcia, Ana Rita da Costa; Brito, Maria Alexandra,1960-; Gomes, Claúdio M.

A falta de conhecimento profundo acerca dos mecanismos subjacentes ao extravasamento da barreira hematoencefálica (BHE) pelas células de cancro da mama, durante a cascata metastática, impede o desenvolvimento de terapias que previnam a formação de metástases cerebrais nos pacientes com cancro da mama. Entre todos os subtipos de cancro da mama, o cancro da mama triplo negativo é o que apresenta o menor número de opções terapêuticas, devido à falta de alvos moleculares definidos. Aliada a este facto, a restrita permeabilidade da BHE torna, atualmente, o tratamento de pacientes com metástases cerebrais num grande desafio, o que explica as pequenas taxas de sucesso e o mau prognóstico de cerca de 2 milhões de pessoas afetadas em todo o mundo. Neste sentido, torna-se urgente atuar previamente à colonização das células de cancro da mama no cérebro. Para tal, é necessário a realização de estudos adicionais que detalhem os mecanismos e os principais intervenientes moleculares na interação entre as células de cancro da mama e o endotélio cerebral, tendo como principais focos de estudo o estabelecimento de uma escala temporal que inclua cada etapa do processo de extravasamento (rolamento, adesão e transmigração/transposição), investigação detalhada do fenótipo de ambos os tipos celulares ao longo do tempo, determinação de alterações ao nível do endotélio e das células de cancro da mama, compreensão dos mecanismos de transposição da BHE e por fim, a elucidação dos marcadores moleculares envolvidos no processo de interação entre as células endoteliais da microvasculatura e as células de cancro da mama. Com base nestas necessidades, com este trabalho objetivamos estabelecer um perfil temporal e espacial das células de cancro da mama e células endoteliais ao longo do extravasamento, identificar os ligandos moleculares que intervém neste processo, pretende-se também avaliar a ocorrência da transição endotelial-mesenquimal ao nível do endotélio, caracterizar as vias de transposição da BHE usadas pelas células de cancro da mama e em simultâneo, avaliar a integridade da barreira ao longo do tempo. Para os nossos estudos, começámos por estabelecer um novo modelo humano de metastização de células de cancro da mama no cérebro in vitro, para o qual usámos um modelo simplificado da BHE in vitro, composto por células humanas endoteliais da microvasculatura cerebral (HBMEC) e ao qual adicionámos as células de adenocarcinoma humano (MDA-MB-231 Br4), uma linha celular de cancro da mama triplo negativo com propensão para a metastização no cérebro. Para avaliar temporal e espacialmente a interação entre as células endoteliais e tumorais, realizámos microscopia confocal e automatizada das culturas puras e mistas, que permitiu monitorizar e replicar a dinâmica celular ao longo de 24 h com aquisição de imagens a cada hora. Os nossos resultados mostraram que, após 1 h de interação, as células tumorais sofrem alterações morfológicas, evidenciadas por um aumento do seu perímetro e uma simultânea diminuição da circularidade e arredondamento, bem como a formação de extensões destas células, conseguindo estas uma maior área de contacto no endotélio. Todas estas características revelaram a aquisição de um fenótipo invasivo pelas células de cancro da mama nos tempos iniciais de interação entre os dois tipos celulares. Para além disso, recorrendo a softwares específicos, foi projetada a distância migrada pelas células, o que sugere que as células tumorais, durante o extravasamento, migraram maiores distâncias até às 3 h de interação entre os dois tipos celulares. Os nossos resultados demonstraram também que as células de cancro da mama, apresentam sobretudo um tipo de migração coletivo. Através da análise espacial das células de cancro da mama em relação à monocamadas endotelial, foram observadas duas posições distintas, designadas por “fora” quando as células tumorais se encontram completamente em cima da monocamada endotelial e “intercaladas” quando estas células se encontram parcial ou totalmente dentro da monocamada, definidos como estadio 1 e 2, respetivamente. Os resultados obtidos demonstraram que as células de cancro da mama rápida e eficientemente intercalam-se entre as células endoteliais, logo após 1 h de interação com as células endoteliais. Após 3 h, foi possível observar que algumas células de cancro da mama, migraram por baixo das células endoteliais. De seguida, com o intuito de caracterizar e identificar as proteínas envolvidas no processo de extravasamento, recorreu-se à técnica de citometria de fluxo. Este estudo permitiu inferir que o antigénio carcinoembrionário (CD66adecb) e a β1 integrina (CD29) não estão envolvidos neste processo, enquanto que o cluster de diferenciação 44 (CD44) e a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) revelaram ter um papel importante no extravasamento, ao nível das células endoteliais, contrariamente ao que acontece nas células malignas. De seguida, realizámos o mesmo tipo de análise para o transportador de glucose 1, de modo a perceber se a interação entre as células tumorais e endoteliais influência o metabolismo destas células, visto que é uma das principais fontes de energia de ambos os tipos celulares. Curiosamente, este estudo evidenciou que o extravasamento promove o aumento do número de células de cancro da mama que expressam este transportador. Relativamente às células endoteliais, a percentagem de células que expressam este transportador de glucose é semelhante nas culturas endoteliais e mistas ao longo do tempo, mas às 3 h de interação observou-se a formação de duas populações endoteliais distintas relativamente aos níveis de expressão deste transportador. De seguida, e para determinar se as células endoteliais sofrem um fenómeno recentemente descrito, designado por transição endotelial-mesenquimal, resultante da interação com as células malignas, foram feitos estudos de imunofluorescência, a partir dos quais avaliámos a expressão de reconhecido marcador mesenquimal, como a caderina neuronal e um marcador de migração celular, como a cinase de miosina de cadeia leve. De acordo com os resultados obtidos, após 3 h de interação entre as células endoteliais e tumorais observou-se um aumento da intensidade de fluorescência de ambos os marcadores estudados. Em simultâneo, estas células adquiriram uma morfologia alongada, evidenciando um fenótipo invasivo, que consequentemente facilita a ocorrência do extravasamento. Sendo este um processo altamente dinâmico, de seguida avaliámos a integridade da BHE através da monitorização das culturas endoteliais e mistas ao longo do tempo, o que revelou que a área coberta por células endoteliais diminui ao longo do tempo, também evidenciado pelo aparecimento de zonas com ausência de células endoteliais na monocamada. Através da marcação da β-catenina, uma das principais proteínas das junções aderentes, nas monocamadas endoteliais e culturas mistas, foi possível concluir que a disrupção da BHE está relacionada com a disrupção deste tipo de junções evidenciada primeiro pela formação de pequenos buracos na marcação, seguida da deslocalização desta proteína juncional da membrana para o citoplasma e núcleo e culmina na observação de grandes espaços entre as células endoteliais. As pontes de contacto entre células endoteliais que se mantiveram encontram-se altamente pressionadas. Curiosamente, ao longo deste estudo, de forma inesperada, percebemos que durante a interação entre os dois tipos celulares, as células de cancro da mama parecem incorporar componentes provenientes das células endoteliais. A partir de estudos adicionais, nos quais transferimos meios de cultura (provenientes de culturas mistas e endoteliais, cujas células endoteliais foram previamente marcadas com CellTracker™ Red CMTPX), observámos que as células de cancro da mama exibiram uma marcação vermelha, principalmente na região perinuclear. Curiosamente, apresentaram um maior número de vesiculas no seu interior, quando utilizado o meio de cultura endotelial. Paralelamente, a concentração de partículas em suspensão em cada um dos meios de cultura antes e após incubação com as culturas tumorais foi avaliada, utilizando o Nanosight. Estes estudos revelaram que após 3 h de incubação, as culturas mistas apresentam uma menor concentração de partículas quando comparadas com as culturas endoteliais. Para além disso, após a incubação das células tumorais com o meio de cultura endotelial, verificámos uma diminuição da concentração de micropartículas em suspensão, comparativamente à sua concentração antes da incubação. Estes resultados evidenciam assim a possível capacidade das células tumorais para incorporaram componentes das células endoteliais durante o extravasamento. No seu conjunto, estes estudos contribuíram para uma melhor compreensão do processo de extravasamento das células de cancro da mama triplo negativo através da BHE, a qual é essencial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que previnam a transposição da BHE pelas células malignas e assim impedir a formação de metástases cerebrais.

2020Master thesis

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