ChangingMoods: Ecological role of unsophisticated cognition within cleaning mutualisms in a changing ocean

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The hidden burden of sociality : effects of simulated infections on social distancing within cleaning interactions

Publication . Marquês, Tânia Raquel dos Santos; Paula, José Ricardo Maceiras de; Repolho, Tiago Filipe Baptista da Rosa

A vida em sociedade acarreta um conjunto de benefícios mas também de custos, nomeadamente pela forma como facilita a transmissão de doenças, o que justifica a necessidade de analisar esta problemática. As espécies sociais são aquelas que formam associações frequentes com outros indivíduos, equilibrando as pressões do ambiente que atuam a nível cognitivo e influenciam o seu comportamento. Quanto às diferentes formas de interação social, estas podem ser classificadas como comensalismo, amensalismo, parasitismo e mutualismo, sendo que esta última interação se reveste de uma relevância social significativa pela forma como beneficia ambos os intervenientes, tal como acontece no mutualismo de limpeza em que o bodião limpador obtém alimento ao remover ectoparasitas e outros elementos prejudiciais ao cliente. Sendo a condição dos indivíduos influenciada pela vida em sociedade, será a complexidade deste modo de vida a poder contribuir para uma mais elevada capacidade cognitiva. No entanto, e dado que no decorrer das interações sociais que são criadas oportunidades para a transmissão de doenças, torna-se fundamental reconhecer os indivíduos que se encontram doentes, permitindo a adoção de estratégias que controlem a transmissão de doenças. O comportamento de doença inclui diversas alterações em relação ao comportamento habitual dos indivíduos, como a letargia, sonolência e anorexia, e é esse conjunto de alterações comportamentais que poderá tornar possível o reconhecimento dos indivíduos que se encontram doentes. De entre as medidas que permitem controlar a transmissão de doenças, e como a recente pandemia veio demonstrar, o distanciamento social é uma estratégia simples e com elevada eficácia para controlar a disseminação de doenças, existindo inúmeros registos de como o distanciamento social é aplicado em outras espécies que não a dos seres humanos. O bodião limpador Labroides dimidiatus incorre num elevado número de interações diárias e, apesar da preferência por muco, opta por remover e se alimentar de ectoparasitas e tecidos não viáveis dos clientes, revelando uma capacidade cognitiva e complexidade comportamental que o tornaram numa espécie amplamente utilizada em estudos ecológicos e comportamentais. Surgiu também recentemente a perspetiva de os peixes limpadores poderem constituir vetores para a transmissão de doenças, em resultado do elevado número de interações diárias que efetuam. Através da sintomatologia que induz, o LPS permite o estudo do comportamento de doença. Deste modo e por intermédio da estimulação imunitária induzida em peixes limpadores, o objetivo desta dissertação foi avaliar se os peixes limpadores e seus clientes manifestavam estratégias de distanciamento social, com recurso a três teste comportamentais: o teste de preferência social, o teste de interação social e o teste de cooperação com audiência. A nível experimental, foram utilizados como modelos biológicos os peixes limpadores da espécie Labroides dimidiatus (n=23) e peixes clientes da espécie Acanthurus leucosternon (n=3), sendo que os limpadores foram mantidos em tanques individuais, e foram divididos em 2 grupos experimentais de 11 indivíduos, o de teste e o controlo (o restante limpador foi utilizado em testes intraespecíficos). A imunoestimulação foi realizada através da injeção intraperitoneal de LPS, com os elementos do grupo de controlo a serem injetados com PBS (Phosphate-buffered saline), e após a realização de todos os procedimentos experimentais, os indivíduos foram sacrificados com MS (Morphine sulfate) e foi removido o baço para calcular o SSI (spleen somatic-index) e validar a ativação do sistema imunitário. Para o teste de preferência social, os indivíduos foram colocados na zona central de um tanque com 3 divisórias, sendo que nas câmaras laterais eram colocados os estímulos (cliente versus NO (Novel non-social object) e limpador versus NO). Após o período de aclimatação foram efetuadas as gravações de vídeo, sendo posteriormente analisadas com recurso ao software ANY-Maze (Stoelting Europe, Ireland). No teste de interação social os limpadores foram colocados num tanque com um cliente, e após o período de aclimatação foi permitida a interação. As gravações de vídeo das interações foram posteriormente analisadas com recurso ao software Boris. Para determinar o possível ajuste do comportamento alimentar os limpadores foram submetidos ao teste do efeito do observador, em que após a fase de aprendizagem lhe eram apresentadas 2 placas (uma delas a representar o observador) e onde deveriam maximizar os seus ganhos alimentando-se contra a sua preferência, para posterior cálculo do bystander score. Todos os dados obtidos foram posteriormente utilizados para análise estatística em R. Em termos de SSI, os limpadores injetados com LPS apresentaram valores mais elevados que os do grupo de controlo. Relativamente ao teste de preferência social, os limpadores imunoestimulados apresentaram níveis reduzidos de atividade, quer para a distância total percorrida quer para a velocidade média, em ambas as situações (cliente versus NO e limpador versus NO). No entanto não houve diferenças significativas no tempo passado na proximidade de qualquer dos estímulos. Quanto às interações, e ainda que os clientes continuassem com comportamentos que demonstram a sua disponibilidade para interagir, os limpadores injetados com LPS tiveram significativamente menos interações que os do grupo de controlo. Através da análise do bystander score foi possível depreender que, enquanto os indivíduos do grupo de controlo mostraram ser capazes de ajustar o seu comportamento alimentar na presença de audiência, aqueles que tinham sido estimulados imunitariamente não ajustaram o seu comportamento. A ativação do sistema imunitário através a injeção com LPS foi validada com base no cálculo do SSI. No entanto, a forma como tal ativação se traduz em alterações comportamentais não é completamente conhecida, tendo sido demonstrado anteriormente que existem diversos fatores, como o género e estatuto social, que influenciam os ajustes comportamentais e que ocorrem em contexto de doença. Os resultados do teste de preferência social permitiram inferir que não ocorreu preferência social, mas que também não ocorreu distanciamento social em relação a qualquer dos estímulos. Considerando a importância do contexto social no comportamento, assim como do tipo de relações estabelecidas, surge a possibilidade de os comportamentos de doença terem sido suprimidos no sentido de evitar a perda dos benefícios da vida social. Dadas as diferenças nos níveis de atividade, que foram inferiores nos indivíduos injetados com LPS, é possível assumir que a letargia manifestada, que se inclui no comportamento de doença, conduz a um auto isolamento passivo, o qual funciona no sentido de diminuir a transmissão de doenças. Quanto às interações entre limpadores e clientes, observou-se uma diferença significativa no seu número, com os limpadores injetados com LPS a interagirem menos, ainda que os clientes continuassem a mostrar disponibilidade para interagir. Torna-se necessário considerar a capacidade que os limpadores têm de considerar interações prévias para decidir como ajustar o seu comportamento e as contingências associadas ao contexto, sendo lícito considerar a capacidade de aprendizagem desta espécie para justificar o número reduzido de interações. Em termos da capacidade de ajustar o seu comportamento na presença de uma audiência, os limpadores injetados com LPS, contrariamente aos do grupo de controlo, não foram capazes de ajustar o seu comportamento alimentar. Até que ponto estes resultados resultam do comportamento de doença induzido ou resultam de outros fatores previamente identificados e passíveis de influenciar o seu comportamento, como as características específicas do seu habitat, é de alguma forma incerto. Em resumo, e ainda que não tenham havido indícios efetivos de que quer os limpadores quer os clientes manifestem distanciamento social, e tendo sido validada a ativação do sistema imunitário, a letargia e o número reduzido de interações poderão ser considerados como mecanismos que indiretamente promovem o distanciamento social dos limpadores em contexto de doença.

2023Master thesis

Open access

Using supervised machine learning to quantify cleaning behaviour

Publication . Oliveira, Raúl Afonso Castelhano de; Paula, José Ricardo; Garcia, Nuno Cruz

Os bodiões-limpadores (Labroides dimidiatus) são conhecidos pela sua função de limpeza nos recifes de coral, onde inspecionam e interagem com peixes clientes, onde removem e alimentam-se de ectoparasitas. Estes peixes limpadores chegam a interagir com mais de 2000 clientes por dia, e algumas clientes procuram os limpadores até 145 vezes por dia. O comportamento de limpeza abrange uma variedade de atividades, incluindo mordidas de limpeza, sacudidelas por parte no cliente, estimulação tátil, perseguição por parte do cliente, danças publicitárias do limpador, punição e manipulação. Estas atividades refletem a motivação de limpeza e a qualidade da interação. O Labroides dimidiatus, um bodião limpador do Indo-Pacífico, é uma das espécies de peixes limpadores mais estudadas no que toca a interações aquáticas mutualísticas. Este peixe serve como modelo para a investigação sobre o desenvolvimento da cooperação interespecífica, visto ser um peixe essencial para o funcionamento dos sistemas de recife de coral. As análises destas interações interespecíficas têm sido tradicionalmente realizadas processando manualmente gravações de vídeo. No entanto, este método é demorado e pode não ser confiável devido à variação entre observadores e à fadiga devido às longas horas analisando gravações de vídeos, portanto, alguns jornais exigem uma análise de interobservadores para validar a análise. À medida que que softwares de rastreamento automático e classificação comportamentais estão se tornando cada vez mais importantes para estudos de comportamento animal (incluindo humanos, ratos e aves), há a necessidade de ferramentas open-source que possam rastrear e quantificar as interações de limpeza. Tanto quanto nos é dado a conhecer, não existem tais ferramentas de open-source que seja capaz de rastrear os peixes e classificar estas interações de limpeza. As ferramentas presentes na literatura, maioritariamente envolver espaços bidimensionais – geralmente ratos, moscas, peixes – por outro lado, parte da literatura que se foca em espaços tridimensionais, trabalham com animais da mesma espécie. Devido à inovação do estudo, a implementação do projeto apresenta diversos desafios significativos por si só. Os problemas incluem desde início a recolha de dados e a gravação de vídeos adequados para o nosso objetivo, neste contexto, algumas variáveis precisam ser abordadas. As variações no tamanho dos Labroides dimidiatus e de seu cliente de aquário para aquário, a disposição do aquário, as variações de luz entre aquários, o facto de estarmos a trabalhar com um espaço tridimensional, serem duas espécies diferentes, com formas relativamente distintas, e por fim, a própria forma do peixe. Todos estes aspetos são algo que vêm dificultar todo o nosso trabalho, isto porque se não conseguirmos ter um modelo que seja capaz de rastrear os peixes, identificando os pontos desejados de forma precisa, não se conseguirá prosseguir para a parte da classificação comportamental. O principal objetivo desta tese é utilizar ferramentas de aprendizagem de automática para criar um sistema semiautomático de rastreamento e identificação para interações de limpeza de Labroides dimidiatus. Ao automatizar procedimentos manuais trabalhosos, este sistema procura agilizar o processo de análise, mantendo a fiabilidade dos dados. Além disso, os dados provenientes do sistema de rastreamento semiautomático serão utilizados para um algoritmo projetados para analisar com foco específico as interações mutualísticas. Ao integrar técnicas de aprendizagem automática no fluxo de trabalho de análise, esta tese procura aumentar a eficácia e rapidez da investigação em ecologia marinha. Inicialmente é necessário identificar ferramentas atuais, parametrizar e adaptar com o objetivo de poder rastrear o movimento das duas espécies de peixes. Para esta tarefa, decidimos então usar a ferramenta DLC (DeepLabCut), a qual é uma ferramenta semiautomática de rastreamento animais. Os dados coletados serão então utilizados num algoritmo para analisar interações interespecíficas. Como resultado, forneceremos uma ferramenta (ou uma definição de configuração para uma ferramenta já existente) que auxiliará os investigadores etólogos que estudam bodiões-limpadores, em particular o Labroides dimidiatus. Neste trabalho foram usadas duas câmaras por aquário, uma camara que grava a parte frontal e outra que grava a parte superior, para que possamos replicar uma gravação tridimensional, potenciando assim a informação obtida pelas gravações dos vídeos. Foram utilizados 6 aquários diferentes com diferentes indivíduos. Visto termos dois ângulos diferentes de câmaras, foram treinadas duas redes neuronais distintas e posteriormente analisadas, obtendo resultados bastante positivos com taxas de erro significativamente baixas. Posteriormente, estes dados foram implementados no algoritmo que tem por base a distância entre os peixes e o tempo que passam perto um do outro. Para calcular a distância, além de diferentes distâncias, foram também testadas diferentes estratégias de medição da distância entre os peixes, que tinha por base o uso de diferentes pontos de referência para calcular a distância. Apesar de não termos conseguido diferenciar os diversos tipos de interações mutualísticas, focamo-nos em diferencias interação de não interação. Os resultados obtidos à primeira vista não são os melhores, mas, contudo, após uma melhor reflexão, chegamos à conclusão que é um excelente passo para a automatização da classificação de interações. O algoritmo com os melhores parâmetros para o nosso estudo, conseguiu identificar 90% das interações totais dos vídeos usados no estudo. Contudo, classificou aproximadamente de 15% das não interações como interações. Apesar de parecer um erro elevado, o algoritmo classificou somente 25% da duração total dos vídeos, como interações. Com isto em mente, mesmo que seja preciso uma verificação por parte de uma pessoa, esta verificação seria no máximo 25% do tempo utilizado caso tivesse que manualmente analisar os vídeos por completo. Este trabalho contribui para a comunidade científica com uma base de dados de vídeos raw e vídeos manualmente anotados de interações mutualísticas de limpeza. Estes vídeos poderão ser utilizados para testar diversas abordagens de rastreamento ou de classificação comportamental, tanto como conjunto de dados de treino, mas também como conjunto de validação de verdade absoluta. Como trabalho futuro, seria necessário aumentar a base de dados, visto ter sido possível com uma porção total dos vídeos disponíveis. Posteriormente seria interessante passar de um ambiente controlado como os aquários no laboratório, para um ambiente natural. No entanto, esta mudança apresentaria alguns obstáculos, principalmente no que diz respeito à colheita e análise de dados. O desenvolvimento de metodologias capazes de rastrear e analisar interações em ambientes de recife exigiria técnicas inovadoras que incluam câmaras subaquáticas, algoritmos de rastreamento mais avançados e técnicas de processamento de dados robustas. A colaboração com especialistas em biologia marinha, visão computacional e aprendizagem automática poderia avançar ainda mais no desenvolvimento de ferramentas automatizadas de rastreamento e classificação adaptadas especificamente para o estudo de interações mutualísticas em ecossistemas de recifes de coral. Ao aproveitar a experiência interdisciplinar e os avanços tecnológicos, a investigação futura pode continuar a expandir os limites do conhecimento em ecologia marinha e análise do comportamento.

2024Master thesis

Open access