Center for Interdisciplinary Research in Animal Health

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Estimating Listeria monocytogenes growth in ready-to-eat chicken salad using a challenge test for quantitative microbial risk assessment

Publication . Bernardo, Rita; BARRETO, ANTONIO; Nunes, Telmo; Henriques, Ana Rita

Currently, there is a growing preference for convenience food products, such as ready-toeat (RTE) foods, associated with long refrigerated shelf-lives, not requiring a heat treatment prior to consumption. Because Listeria monocytogenes is able to grow at refrigeration temperatures, inconsistent temperatures during production, distribution, and at consumer’s household may allow for the pathogen to thrive, reaching unsafe limits. L. monocytogenes is the causative agent of listeriosis, a rare but severe human illness, with high fatality rates, transmitted almost exclusively by food consumption. With the aim of assessing the quantitative microbial risk of L. monocytogenes in RTE chicken salads, a challenge test was performed. Salads were inoculated with a three-strain mixture of cold-adapted L. monocytogenes and stored at 4, 12, and 16 °C for eight days. Results revealed that the salad was able to support L. monocytogenes’ growth, even at refrigeration temperatures. The Baranyi primary model was fitted to microbiological data to estimate the pathogen’s growth kinetic parameters. Temperature effect on the maximum specific growth rate (μmax) was modeled using a square-root-type model. Storage temperature significantly influenced μmax of L. monocytogenes (p < 0.05). These predicted growth models for L. monocytogenes were subsequently used to develop a quantitative microbial risk assessment, estimating a median number of 0.00008726 listeriosis cases per year linked to the consumption of these RTE salads. Sensitivity analysis considering different time–temperature scenarios indicated a very low median risk per portion (<−7 log), even if the assessed RTE chicken salad was kept in abuse storage conditions.

2020-11Journal article

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Oxa-181-producing extraintestinal pathogenic escherichia coli sequence type 410 isolated from a dog in Portugal

Publication . Brilhante, Michael; Menzes, Juliana; Belas, Adriana; Feudi, Claudia; Schwarz, Stefan; Pomba, C.; Perretena, Vincent

Two multidrug-resistant and carbapenemase-producing Escherichia coli clones of sequence type 410 were isolated from fecal samples of a dog with skin infection on admission to an animal hospital in Portugal and 1 month after discharge. Whole-genome sequencing revealed a 126,409-bp Col156/IncFIA/IncFII multidrug resistance plasmid and a 51,479-bp IncX3 blaOXA-181-containing plasmid. The chromosome and plasmids carried virulence genes characteristic for uropathogenic E. coli, indicating that dogs may carry multidrug-resistant E. coli isolates related to those causing urinary tract infections in humans.

2020-03-24Journal article

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Pheno and genotyping of Salmonella from slaughtered pigs in a Portuguese abattoir reveal differential persistence ability

Publication . Cota, João Bettencourt; Silva, Vanessa Ferreira da; Chambel, Lélia; Veloso, Maria Gabriela; Vieira-Pinto, Madalena; Oliveira, Manuela

ABSTRACT - Pork is one of the most common vehicles of non-typhoid foodborne Salmonella, with the slaughterhouse representing a key point for the infection of pigs and carcass contamination. By comparing matching samples taken from animals at the dirty (skin) and clean (inner and outer carcass surface) areas of the slaughterline, this study aimed to assess potential Salmonella contamination routes of pig carcasses within a Portuguese abattoir. Forty-four Salmonella isolates were retrieved from 120 pigs, and further characterized through pheno and genotypical methods. Most frequent serotypes found were Salmonella 4, [5],12:i:- (47.7%), Salmonella Rissen (40.9%) and Salmonella Derby (11.4%). Isolates were most commonly collected from the skin of pigs sampled at the dirty area (59.1%), followed by the inner (38.1%) and outer (9.1%) carcass surface sampled at the clean area. Most isolates (79.5%) were considered to be multidrug resistant and all harbored the virulence associated genes invA, invH, sopB, stn, slyA, phoP, phoQ and agfA. PFGE analysis revealed that most bacterial isolates belonging to the same serotype, recovered from animals from different farms, and slaughtered at separate days were genetically undistinguishable. Furthermore, our findings suggest that Salmonella Rissen might have an increased ability to endure on the slaughterhouse environment when compared with the other serotypes. Concluding, this study shows that the slaughterhouse may be a key point for the dissemination of resistant and virulent Salmonella strains, which stresses the importance of the implementation of good hygiene practices at the slaughterhouse and of the application of corrective measures to avoid cross-contamination.

2019-12-01Journal article

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Development of a new immunoliposome drug delivery system for treatment of pneumococcal meningitis

Publication . Silva, Marta Lisete Santos da; Silva, Frederico Aires da; Leão, Raquel Sá

A meningite pode ser definida como um processo inflamatório que envolve as meninges, quer as do sistema nervoso central quer as da medula espinal. Dos vários tipos de meningite descritos, a bacteriana é considerada o tipo mais severo. Streptococcus pneumoniae é considerado um dos principais agentes patogénicos responsáveis por este tipo de meningite causando uma alta taxa de mortalidade e morbilidade, e sequelas neurológicas nos sobreviventes. S. pneumoniae é um patógeno humano que coloniza essencialmente a nasofaringe em crianças, sendo uma causa importante de infeções na infância. S. pneumoniae é uma bactéria Gram-positiva, que frequentemente expressa uma cápsula polissacarídea, que constitui um dos seus principais fatores de virulência. Até ao momento, um total de 98 tipos de polissacarídeos capsulares foram descritos diferindo serológica e estruturalmente entre si. Após a colonização, a translocação através da barreira hematoencefálica (BHE) é uma das etapas cruciais para a patogénese da meningite. Têm sido desenvolvidas várias abordagens farmacêuticas com o intuito de combater a infeção causada por S. pneumoniae. No entanto, um grande obstáculo ao tratamento da meningite pneumocócica é a necessidade de desenvolver terapêuticas capazes de atravessar a BHE. A estrutura da barreira hematoencefálica leva a concluir que para criar um tratamento eficiente para a meningite pneumocócica, é necessária uma abordagem constituída por duas partes essenciais: o desenvolvimento do medicamento com as propriedades antibacterianas e a tecnologia de direcionamento para permitir que a molécula atravesse a BHE e seja capaz de combater a infeção. O foco atual é encapsular antibióticos em formulações lipossomais aumentando a atividade antibacteriana e as propriedades farmacocinéticas o que vai trazer várias vantagens ao sistema de administração de medicamentos como, por exemplo: diminuição da toxicidade, alta atividade antimicrobiana contra patógenios, seletividade do alvo e uma melhor biodistribuição. Desta forma, o principal objetivo deste projeto é desenvolver um sistema de administração de fármacos capaz de atravessar a BHE e libertar antibióticos para combater a meningite pneumocócica. Para atingir esse objetivo, propomos uma nova abordagem que engloba as propriedades da administração de fármacos e o direcionamento específico de um imunolipossoma. Para que o imunolipossoma seja direcionado com sucesso para a BHE, dois anticorpos de pequeno domínio, nomeadamente FC5 [55] e G3 (um sdAb recentemente selecionado pelo nosso grupo que é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica), foram acoplados na superfície do lipossoma, permitindo o transporte do lipossoma através da BHE. O uso de anticorpos de pequeno domínio tem várias vantagens relativamente ao uso de IgG, devido ao seu tamanho reduzido, o que facilita o acesso ao alvo. Adicionalmente, estas moléculas são mais estáveis quando em circulação permitindo uma administração mais eficiente. Em suma, ao conjugar a capacidade de um anticorpo de pequeno domínio específico para o direcionamento e translocação da BHE e o encapsulamento de antibióticos no lipossoma é possível criar um sistema capaz de superar os dois obstáculos no desenvolvimento de um tratamento para a meningite pneumocócica: a necessidade de uma terapêutica capaz de atravessar a BHE e as propriedades antimicrobianas necessárias para combater S. pneumoniae. Dessa forma, a libertação gradual dos antibióticos no foco da infeção, resulta num sistema eficiente de administração de medicamentos para o tratamento da meningite pneumocócica. Para o desenvolvimento do projeto foram encapsulados em lipossomas três dos antibióticos mais recorrentemente utilizados no tratamento desta infeção (penicilina, vancomicina e ceftriaxona) com o objetivo de explorar o seu potencial no tratamento da meningite pneumocócica. Para isso, a concentração inibitória mínima dos três antibióticos encapsulados foi determinada em vários serótipos de S. pneumoniae. Uma vez validada a eficiência dos lipossomas encapsulados, foi possível prosseguir para o desenvolvimento de um imunolipossoma. O primeiro passo para o seu desenvolvimento consistiu na expressão dos anticorpos de pequeno domínio em bactérias, e, seguidamente, a sua purificação. Uma vez obtidos os anticorpos , estes foram ligados à superfície do lipossoma. Para esta ligação foram otimizados dois métodos diferentes amplamente utilizados para o efeito: o método da biotina e o método da maleimide. Uma vez otimizados os métodos de ligação, os imunolipossomas obtidos pelos dois métodos foram sujeitos a estudos de translocação para avaliar a sua capacidade de atravessar a BHE. Os estudos de translocação foram realizados utilizando um modelo da BHE in vitro. Através destes estudos verificou-se que o método de ligação usando a biotina é um método de ligação mais eficaz permitindo uma maior translocação do imunolipossoma. Da mesma forma, foi possível concluir que o anticorpo G3 tem uma maior capacidade para atravessar a BHE quando comparado com o FC5. Esta abordagem permitiu o desenvolvimento de um imunolipossoma capaz de atravessar a BHE encapsulando antibióticos capazes de combater S. pneumoniae. Resumidamente, a estratégia estudada no presente projeto resultou num imunolipossoma que poderá corresponder a uma abordagem mais segura e eficiente no tratamento da meningite pneumocócica e ser um candidato promissor no tratamento de outras doenças do sistema nervoso central.

2019Master thesis

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Impact of leporid viral diseases in Iberian ecosystems : emergence, pathophysiology, prophylaxis and diagnosis

Publication . Santos, Fábio Alexandre Abade dos; Duarte, Margarida Dias; Peleteiro, Maria da Conceição Cunha e Vasconcelos; Parra Fernández, Francisco

ABSTRACT - The alarming state of conservation of leporid species in the Iberian Peninsula justifies the adoption in this Doctoral Thesis of an integrative approach that includes the study of different aspects of the virus-host-environment interfaces with respect to the main viral pathogens of the wild rabbit (Oryctolagus cuniculus algirus) and the Iberian hare (Lepus granatensis) in Mediterranean ecosystems. The studies to which this thesis refers to have used and developed methodologies of molecular and cellular biology, genetics, virology, immunology and pathology, applied to the wild rabbit and the Iberian hare, establishing as objectives of this Thesis the pathophysiological research of the diseases caused by rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV2), myxoma virus (MYXV) and leporid gammaherpesvirus 5 (LeHV-5), their impact on affected species, the design of new diagnostic methods and the search for control measures to mitigate the effects of these agents. In addition to reflecting on the correct interpretation of molecular diagnoses in the context of the virus-host relationship, as a previous step to the presentation of the experimental results, some methodologies have been developed which were necessary for their implementation, such as the extraction of blood through the external jugular vein in wild rabbits and Iberian hares, or simple procedures in order to obtain primary cultures from leporid fibroblasts. In this thesis it has been shown that the Eurasian badger (Meles meles) is susceptible to RHDV2 and that this species can act as a potential reservoir of the rabbit hemorrhagic disease virus. It was also shown that the same RHDV2 strain isolated from badgers could infect a dwarf rabbit, who had a prolonged (atypical) illness and a history of vaccination ineffectiveness with a commercial RHDV vaccine still available on the Portuguese market. With regard to myxomatosis, this thesis includes the detection and analysis of the first cases of this disease in Iberian hares, associated with a natural recombinant strain of the virus (ha-MYXV), as well as the first demonstration that the recombinant virus of hares can infect both wild and domestic rabbits. Additionally, evidence of the first cases of co-infection of the recombinant virus ha-MYXV and the classic myxoma virus MYXV is reported, both in wild rabbits and in Iberian hares. In an attempt to provide solutions for the control of myxomatosis in wild leporids, it has been shown that commercial homologous vaccines against myxomatosis are effective in wild rabbits against the new naturally recombinant strain ha-MYXV, but failed to protect the Iberian hare against myxomatosis. ...

2022-12-05Doctoral thesis

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