Preventing Memory Loss in Alzheimer`s Disease: Underlying Mechanisms and Therapeutic Targets of Tauroursodeoxycholic Acid

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Using TUDCA to treat Alzheimer's disease after pathology onset in APP/PS1 mice

Publication . Dionísio, Pedro Elói Antunes; Amaral, Joana D.; Rodrigues, Cecília M. P.

A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência, constituindo um problema de saúde pública grave, devido ao aumento da esperança média de vida da população mundial, bem como ao longo período de progressão desta doença incapacitante. A AD é caracterizada, em termos patológicos, por acumulação de péptido amilóide-β (Aβ), a nível extracelular e de tranças neurofibrilares intraneuronais, compostas por agregados de proteína tau hiperfosforilada, em regiões cerebrais específicas. A neuroinflamação crónica e a perda progressiva de neurónios, sinapses e matéria branca são características adicionais que também estão associadas à doença. O ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) é um ácido biliar endógeno, anti-apoptótico, capaz de atravessar a barreira hematoencefálica e que apresenta fortes propriedades neuroprotectoras, em diversos modelos experimentais de AD. Resultados obtidos anteriormente pelo nosso grupo demonstraram a eficácia terapêutica do TUDCA em murganhos duplamente transgénicos APP/PS1, antes de estes apresentarem deposição de placas amilóides. Neste estudo, o tratamento preventivo com TUDCA resultou, não só na diminuição da produção e acumulação de Aβ, como também na redução da activação da resposta glial face à acumulação de agregados amilóides. É de salientar que o tratamento com TUDCA conduziu a melhorias na memória dos animais, o que poderá estar relacionado com a diminuição da perda de sinapses, também observada. No estudo agora apresentado, pretendeu-se avaliar os efeitos protetores do TUDCA, quando administrado após o desenvolvimento da patologia amilóide no mesmo modelo transgénico de AD. Os murganhos APP/PS1 com 7 meses de idade foram injetados intraperitonealmente com TUDCA (500 mg/kg), a cada 3 dias, durante 3 meses. Após a realização do teste aquático de Morris, destinado à avaliação da memória espacial dos murganhos, os animais foram sacrificados e um dos hemisférios cerebrais foi processado para análise imunohistoquímica (IHC). O outro hemisfério foi preservado para isolamento do hipocampo e córtex frontal e posterior extração de RNA e proteínas. xii O tratamento com TUDCA levou a uma diminuição significativa da deposição de Aβ em ambas as regiões cerebrais analisadas, com uma maior redução detetada no hipocampo. Esta observação explica-se, provavelmente, pelo facto de neste modelo transgénico, o hipocampo apresentar placas amilóides apenas a partir dos 2-3 meses, enquanto que o neocórtex apresenta depósitos de Aβ logo a partir das 6 semanas. Contudo, ensaios de ELISA confirmaram que os níveis de Aβ40 e Aβ42 estavam significativamente diminuídos em ambas as regiões, após o tratamento com TUDCA. Estes resultados estão de acordo com a diminuição do processamento amiloidogénico da proteína precursora do Aβ (APP) observada no córtex e hipocampo, e sugerem que o tratamento com TUDCA interfere na produção de Aβ. Avaliaram-se também os níveis de fosforilação de resíduos específicos da proteína cinase B, ou Akt, e da cinase da glicogénio sintase 3β (GSK3β), que se relacionam indiretamente com os seus níveis de atividade. A enzima Akt, quando ativa, encontra-se fosforilada no resíduo de serina 473, podendo então fosforilar a GSK3β na serina 9, o que inibe a atividade desta. É de salientar que o eixo Akt/GSK3β se encontra desregulado na AD. A enzima Akt é alvo da via controlada pela fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K), estando ambas envolvidas na ativação de mecanismos de sobrevivência neuronal e de potenciação sinática. A GSK3β encontra-se amplamente descrita como estando hiperativada na AD, ,parecendo envolvida em inúmeros processos associados à progressão da doença. Por exemplo, a GSK3β é uma das principais enzimas responsáveis pela fosforilação de vários resíduos da proteína tau, pelo que a sua desregulação se encontra associada à hiperfosforilação da tau. Mais ainda, a GSK3β tem a capacidade de fosforilar a APP num resíduo citoplasmático, o que pode contribuir para a produção de Aβ. Curiosamente, a inibição da atividade desta cinase parece diminuir a expressão da β-secretase (BACE1), reduzindo o processamento amiloidogénico da APP e, consequente, a produção de Aβ. A GSK3β surgiu recentemente como um mediador-chave da ativação microglial e astroglial em condições inflamatórias, incluindo na AD. Neste sentido, a inibição desta cinase in vivo tem o potencial de melhorar significativamente as patologias associadas à AD. Como seria de esperar, a análise por Western blot (WB) revelou uma diminuição dos níveis de fosforilação da Akt e da GSK3β no córtex, bem como uma diminuição nos níveis de fosforilação da GSK3β no hipocampo de murganhos APP/PS1. Em contrapartida, os animais transgénicos tratados com TUDCA apresentaram níveis de fosforilação destas enzimas semelhantes aos detetados nos murganhos controlo, o que sugere que o TUDCA normaliza os níveis de atividade destas enzimas, no contexto da AD. Os níveis de fosforilação do resíduo de serina 396 da proteína tau, que se encontram aumentados nos murganhos APP/PS1, foram igualmente diminuídos pelo tratamento com TUDCA. Como este resíduo é um alvo importante da GSK3β, a diminuição dos seus níveis de fosforilação poderão indicar a reposição da atividade da GSK3β pelo TUDCA. Verificou-se ainda que, ao contrário do esperado, o tratamento com TUDCA não afetou o nível de fosforilação da APP e a quantidade de BACE1 presente nos cérebros dos murganhos transgénicos tratados, face ao observado nos murganhos transgénicos não tratados, indicando que a atividade desregulada da GSK3β não modula estas vias neste modelo animal, ou que outros mecanismos moleculares poderão estar envolvidos. Neste estudo, e à semelhança de outros anteriores, o tratamento com TUDCA atenuou significativamente a ativação pro-inflamatória dos astrócitos e da microglia em redor das placas amilóides. De igual modo, o tratamento com TUDCA conduziu a uma diminuição significativa dos níveis de mRNA do factor de necrose tumoral α (TNFα), uma das citocinas pro-inflamatórias aumentadas na AD e envolvidas na progressão da doença. Relativamente ao conteúdo sinático, detetou-se uma diminuição nos níveis da proteína sinaptofisina no giro denteado do hipocampo de murganhos APP/PS1, que se correlaciona com a disfunção destas estruturas e a desregulação neurológica generalizada. Esta redução foi parcialmente revertida nos animais tratados com TUDCA, podendo dever-se ao aumento de atividade da cinase Akt que se encontra envolvida na potenciação da resposta sinática ou, simplesmente, à diminuição dos níveis de Aβ. Contudo, os estudos comportamentais permitiram concluir que o tratamento tardio com TUDCA, apesar de melhorar alguns aspetos da patologia, ao nível molecular, não melhora significativamente a perda de memória espacial dos murganhos APP/PS1, tendo-se observado apenas uma tendência para tal. Esta observação poderá advir do facto destes animais já manifestarem défices de memória desde os 7 meses de idade, altura em que se iniciou o tratamento com TUDCA. Em conclusão, os resultados obtidos neste trabalho demonstraram a eficácia terapêutica do TUDCA quando administrado a murganhos APP/PS1 já com características patológicas associadas à AD. O TUDCA atenua a produção e deposição de Aβ, a hiperfosforilação da proteína tau, a activação glial e a perda de integridade sináptica, sendo que vários destes efeitos poderão dever-se, especificamente, à modulação da via Akt/GSK3β. Estes dados sugerem que a utilização do TUDCA não reverte as condições patológicas associadas à perda de memória emergentes ou já existentes na AD sendo, no entanto, uma estratégia terapêutica promissora para atenuar ou retardar a progressão da doença.

2014Master thesis

Open access

Synthetic Condensed 1,4-naphthoquinone Derivative Shifts Neural Stem Cell Differentiation by Regulating Redox State

Publication . Santos, Daniela M.; Santos, Maria M. M.; Moreira, Rui; Solá, Susana; Rodrigues, C. M. P.

Naphthoquinones are bioactive compounds widespread in nature that impact on several cellular pathways, including cell proliferation and survival, by acting as prooxidants and electrophiles. We have previously described the role of the synthetic isoxazole condensed 1,4-naphthoquinone derivative 1a in preventing apoptosis induced by distinct stimuli in several cell models. In addition, apoptosis regulators and executioners may control neural stem cell (NSC) fate, without involving cell death per se. Here, we hypothesize that 1a might also play a role in NSC fate decision. We found that exposure to 1a shifts NSC differentiation potential from neurogenic to gliogenic lineage and involves the generation of reactive oxygen species, without increasing cell death. Modulation of caspases and calpains, using cysteine protease inhibitors, failed to mimic 1a effects. In addition, incubation with the naphthoquinone derivative resulted in upregulation and nuclear translocation of antioxidant responsive proteins, Nrf2 and Sirt1, which in turn may mediate 1a-directed shift in NSC differentiation. In fact, antioxidants halted the shift in NSC differentiation potential from neurogenic to gliogenic lineage, while strongly reducing reactive oxygen species generation and Nrf2 and Sirt1 nuclear translocation in NSC exposed to 1a. Collectively, these data support a new role for a specific naphthoquinone derivative in NSC fate decision and underline the importance of redox environment control.

2013Journal article

Unknown

Fine-tuning neurogenesis : microRNA regulatory networks

Publication . Morgado, Ana Luísa Silva Neves, 1988-; Solá, Susana, 1976-

Neurogenesis, the process of producing neurons from neural stem cells (NSCs) occurs in discrete areas of the adult mammalian brain. However, NSCs produce very few neurons following injury or pathological conditions. Thus, the identification of novel players that improve neurogenesis may have huge impact in the development of strategies for neural repair. Recent discoveries have revealed that microRNAs (miRNAs or miRs) have important roles in stem cell biology, controlling stem cell fate and behavior. Strikingly, additional evidence suggests the involvement of apoptosis-associated miRNAs in stem cell differentiation. Thus, our studies were conducted with the purpose of further characterizing the molecular mechanisms by which specific apoptosis-associated miRNAs regulate NSC differentiation to ultimately improve neurogenesis as an alternative to cell loss. In initial studies we evaluated the expression of specific apoptosis-associated miRNAs during the differentiation process of mouse NSCs. Validation by qRT-PCR revealed that pro-apoptotic miR-16, let-7a, let-7b, miR-34 family members, and miR- 143/145 cluster, as well as anti-apoptotic miR-21 are differentially expressed throughout NSC differentiation. We further investigated the role of two of the most modulated miRNAs. First, we assessed the impact of miR-34a during neuronal differentiation. We showed that miR- 34a is significantly downregulated during NSC differentiation and that miR-34a overexpression significantly impairs neurogenesis progression. Additionally, we demonstrated that miR-34a downregulation is crucial to allow upregulation of synaptotagmin 1 (Syt1) and autophagy-related 9a (Atg9a) proteins, essential for differentiation to progress. Finally, we explored the role of miR-145 in NSC differentiation. We discovered that neuronal differentiation was associated with a marked increase in miR-145 levels and reported that forced miR-145 downregulation negatively affects this process. Additional experiments, in turn, indicated that miR-145 regulates differentiation of mouse NSCs through the sex-determining region Y-box 2 (Sox2)– Lin28/let-7 pathway. These results demonstrate that miR-34a downregulation and miR- 145 upregulation are required for proper neuronal differentiation. In conclusion, our findings clarify the role of miR-34a and miR-145 during neuronal differentiation and may prove useful in the development of novel therapeutic strategies to improve long-term survival and differentiation of endogenous and/or transplanted stem cells.

2015Doctoral thesis

Restricted access