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Projeto de investigação
ONTology-based Web Database for Understanding Amyotrophic Lateral Sclerosis<br>
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Biomarcadores respiratórios na abordagem clínica da esclerose lateral amiotrófica
Publication . Pronto-Laborinho, A.C.; Carvalho, Mamede Alves de; Carvalho, Filomena Maria Dias de Almeida
A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa de progressão rápida e fatal, caracterizada pela rápida destruição dos neurónios motores localizados no córtex motor, tronco cerebral e na medula espinhal, associada a um processo neuro-inflamatório cujo papel etiopatogénico não está bem esclarecido. Clinicamente, observa-se uma grave diminuição da força muscular, envolvendo os membros superiores e inferiores, os músculos da deglutição e da fala, e os músculos respiratórios. A insuficiência respiratória é a principal causa de morte, que ocorre, em geral, 3-5 anos após o aparecimento dos primeiros sintomas. A maioria dos casos de ELA, 90-95%, são de etiologia desconhecida (ELA esporádica). Nos restantes 5-10% dos casos há outros membros afectados na família (ELA familiar).
O único fármaco aprovado na Europa, Riluzol, apenas confere um modesto aumento na sobrevida destes pacientes. Actualmente, nenhum tratamento de relevante eficácia está disponível, apesar dos persistentes esforços para encontrar novos medicamentos, resultando em centenas de ensaios clínicos muito dispendiosos. Tal deve-se, sobretudo, ao facto dos mecanismos envolvidos na origem da ELA serem complexos, multifactoriais e não conhecidos. O diagnóstico da doença demora cerca de 9-12 meses, fundamentalmente devido à ausência biomarcadores moleculares de diagnóstico.
Sendo um determinante crítico do prognóstico, a função respiratória deve ser monitorizada no curso da progressão da doença. Tal processo ocorre pela avaliação clínica e execução de provas da função respiratória, eventualmente complementada com métodos de imagem ou neurofisiológicos. Não tem havido um marcador molecular que seja relevante para o diagnóstico precoce ou no prognóstico da insuficiência respiratória. Tal pode ter implicações na implementação de medidas adequadas de reabilitação respiratória, tal como o suporte ventilatório.
Nesta tese, pretendeu-se identificar novos biomarcadores relacionados com a insuficiência respiratória na ELA. Como objectivo secundário explorou-se a associação entre a função respiratória e as propriedades eritrocitárias, de forma a melhor compreender a hipóxia tecidular.
De modo a identificar um biomarcador molecular de disfunção respiratória na ELA, estudaram-se a proteína Club cell secretory protein (CC-16), a interleucina-6 (IL-6), e a creatinina (Cr). Adicionalmente, analisou-se o papel do fibrinogénio ’ na ELA como marcador da disfunção respiratória e da inflamação na ELA.
Relativamente às propriedades eritrocitárias efectuou-se a caracterização biofísica, hemorreológica e morfológica destas células.
Foram incluídos doentes com ELA regularmente seguidos na consulta dedicada a esta doença na Unidade de Neuromuscular do CHULN-H Santa Maria, respeitando os critérios de diagnóstico para esta doença e excluindo doentes com outras patologias médicas. Os valores obtidos foram comparados com os obtidos numa população de controlo com similar idade e distribuição por género. Os doentes tiveram seguimento regular na consulta, com avaliação clínica (escala funcional ALSFRS-R), provas de função respiratória (espirometria, pressões máximas, SNIP, estudo neurofisiológico do nervo frénico) e registo dos eventos, como a data da introdução da ventilação não-invasiva, a morte ou a traqueostomia.
Foram aplicadas diversas técnicas laboratoriais, em particular ELISA (CC-16), tecnologia Multiplex (IL-6), microscopia de força atómica (AFM), medidas do potencial Zeta e técnicas hemorreológicas, para além de outras técnicas e metodologias utilizadas de rotina no nosso centro.
Os resultados mostraram que na população de doentes os valores de CC-16 estavam significativamente mais elevados, sem correlação com a idade, forma de apresentação ou duração da doença, ALSFRS-R, FVC (“Forced vital capacity”) ou com a amplitude da resposta do nervo frénico. No entanto os doentes com níveis mais elevados de CC-16 apresentavam um risco acrescido da necessidade de ventilação não-invasiva nos seis meses seguintes, e tendiam para uma maior mortalidade nos 30 meses seguintes.
Níveis aumentados de IL-6 foram observados doentes com ELA, quando comparados com o grupo controlo. Nestes, os valores tinham correlação positiva com a idade. Na população de doentes, foi encontrada uma correlação negativa independente da idade entre os níveis de IL-6 e os valores da amplitude da resposta do nervo frénico.
Embora a creatinina seja um factor preditivo da perda funcional e da sobrevida, na ELA, na nossa amostra não foi possível confirmar ser este marcador preditor da função respiratória (FVC) ou do seu declínio.
Da avaliação da quantificação plasmática do fibrinogénio ’ observaram-se valores mais elevados nos pacientes de ELA quando comparados com o grupo controlo, níveis mais elevados foram associados a maior sobrevida.
Os eritrócitos de doentes ELA, estavam morfologicamente alterados quando comparados com os eritrócitos do grupo controlo, tendo uma membrana menos rugosa, menor área, menor volume, menor diâmetro, mas sendo mais alongados. Os eritrócitos dos pacientes de ELA tendem a perder a concavidade. Adicionalmente, por quantificação do potencial Zeta, observou-se que a carga superficial da membrana eritrocitária é mais negativa, quando comparada com os controlos. Estudos de espectroscopia de força por AFM para analisar as propriedades elásticas dos eritrócitos revelaram que os eritrócitos dos pacientes de ELA são mais deformáveis, menos rígidos e têm maior profundidade de penetração que os eritrócitos dos indivíduos controlo.
Em suma, os resultados revelam um aumento da resposta inflamatória pulmonar relacionada com a disfunção respiratória. As alterações nas propriedades hemorreológicas e morfológicas dos eritrócitos poderão promover interacções entre moléculas inflamatórias e o eritrócito, eritrócito-fibrinogénio e/ou eritrócito-eritrócito, promovendo um factor de risco adicional para eventos tromboembólicos venosos e de hipoxia tecidual, associados à progressão da doença. Em resumo, os nossos resultados permitiram:
1- Identificar potenciais novos marcadores moleculares de disfunção respiratória na ELA, com valor preditivo no diagnóstico e prognóstico, bem como potencial utilização em futuros ensaios clínicos;
2- Identificar alterações na elasticidade e rigidez dos eritrócitos dos pacientes de ELA bem como alterações morfológicas no eritrócito e hemorreológicas, nos pacientes com ELA.
Os resultados da tese devem incentivar estudos futuros. O papel das alterações da membrana eritrocitária na hipoxia tecidual é uma questão inovadora relevante que merece uma investigação mais profunda.
Young-onset rapidly progressive ALS associated with heterozygous FUS mutation
Publication . Gromicho, Marta; Oliveira Santos, Miguel; Pinto, Anabela; Pronto Laborinho, Ana Catarina; Carvalho, Mamede
We report a 36-years-old Cape Verdean man who presented with respiratory insufficiency due to rapidly progressive sporadic amyotrophic lateral sclerosis (ALS), in whom FUS mutation c.1551C > G (p.Hist517Gln) in heterozygosity was identified, a finding previously described as non-pathogenic. The only previous report on this mutation was in a family from Cape Verde in which four members developed ALS; all were homozygous for the mutation. This case shows that this FUS mutation presents a highly variable penetrance and expressivity.
Fasciculation discharge frequency in amyotrophic lateral sclerosis and related disorders
Publication . Carvalho, Mamede; Swash, Michael
Objective: In amyotrophic lateral sclerosis (ALS), fasciculations are believed to become less frequent during disease progression, associated with the loss of motor units. To address this issue, we studied the variation of fasciculation potential (FPs) frequency as evaluated by surface electromyography of the first dorsal interosseous muscle (1st DI) in patients with ALS and other related disorders, and to relate this change with the neurophysiological index (NI), a surrogate measure of functional motor units.
Methods: We measured the FP frequency and mean amplitude during a two minute recording of the relaxed right first dorsal interosseous muscle (1st DI) in 34 ALS patients, 9 subjects with benign fasciculations (BFS), 6 with primary lateral sclerosis (PLS) and 4 with spinal muscle atrophy (SMA). ALS patients were evaluated 2-5times at 4month intervals, people with BFS were evaluated 3-4 times at the same interval, those with SMA and PLS were evaluated at 6month intervals 2-4times. The NI was derived from the amplitude of the motor response and F-wave frequency after distal ulnar nerve stimulation.
Results: The NI decreased significantly in ALS (p<0.001) but not in the other groups. At baseline, the median FP frequency was 0.29Hz in the ALS group and did not change significantly. During progression, in some ALS patients with very weak 1st DI the FP frequency increased. In subjects with BFS the mean FP frequency was 0.28Hz at entry and remained stable. In patients with PLS FPs were less frequent (median 0.038Hz) but more frequent in SMA patients (median 1.15Hz). In both groups their firing frequency did not change. During the study the mean amplitude of FPs was unchanged in all groups.
Conclusion: In ALS, the generators of FPs remain active even when the number of motor units is quite reduced, consistent with increased motoneuron excitability associated with unstable axonal sprouts during the process of continuous partial reinnervation. In BFS and other neuromuscular disorders, including SMA, the FP frequency is stable over time, suggesting mature motor axons that are not hyperexcitable and less prone to ectopic activity.
Significance: In ALS, the FP firing frequency does not decline significantly over several months, in spite of a marked reduction in the number of functional motor units.
Association of the practice of contact sports with the development of amyotrophic lateral sclerosis
Publication . Henriques, Ana; Gromicho, Marta; Grosskreutz, Julian; Kuzma-Kozakiewicz, Magdalena; Petri, Susanne; Uysal, Hilmi; Pinto, Susana; Antunes, Marilia; Carvalho, Mamede; Ribeiro, Ruy
Objectives: High-intensity physical activity and sports prone to repetitive injuries of the cervical spine and head (when associated with vigorous practice) have been suggested as possible risk factors for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Our objective was to evaluate the relationship between the practice of contact sports (boxing, hockey, football, rugby) and ALS. Methods: The study included 2247 individuals, 1326 patients and 921 controls from several European countries. Analysis of the effect of contact sports on ALS was conducted in male participants only, as very few women practiced contact sports. Logistic regression models were used with the response variable as the presence or absence of ALS, with α = 0.05 significance level. Results: A relationship between the practice of contact sports and ALS was found, with those practicing contact sports having 76% higher odds of an ALS diagnosis (OR = 1.76, p = 0.001). In addition, univariate analyses for age (higher risk for older people, p < 0.001), smoking status (higher risk for ex-smokers, p = 0.022) and tobacco exposure (higher risk for more exposure, p = 0.038) also indicated that these variables are risk factors for ALS. In multivariate models, in addition to age, the interaction term between practice of contact sports and tobacco exposure was still significant (p = 0.03). Conclusions: This is one of the largest studies on the role of contact sport in ALS development. Our results support the existence of a relationship between the practice of sports with repetitive trauma at the level of the cervical spine and head, and ALS. This risk appears to be enhanced by tobacco exposure.
Seasons and ALS time of death
Publication . Pinto, Susana; Carvalho, Mamede
Introduction: Respiratory complications are the main cause of death in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Season-associated-death risk was not addressed before.
Objective: To assess month/season-associated death risk in ALS.
Methods: We included all patients followed in our unit who died before 1 January 2016, excluding those with uncertain information. A χ2 test assessed differences between months/seasons. A two-step cluster analysis explored the significant survival independent factors. Values of p < 0.05 or p < 0.01 (multiple comparisons) were considered significant.
Results: From 778 patients, 543 had died at censor date. Absolute death number was 46,46,37,47,38,50,41,43,41,48,40,66, for each month from January to December. No significant difference existed when considering all months and seasons globally (p > 0.05). Significant differences were found comparing December (highest rate, 12.2%) with March, May, July, August, September, November (p < 0.05). Deaths were higher in winter than in spring (p = 0.031), but similar between winter and summer (p = 0.16), and winter and autumn (p = 0.087). Bulbar-onset patients had a relatively increased death rate in summer, while spinal-onset patients died more frequently in winter.
Discussion: Death risk factors are probably dehydration for patients with dysphagia during summer and respiratory infections for patients with weak cough during winter. Flu vaccination, better ventilatory/cough assistance in winter and hydration in summer are recommended.
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Entidade financiadora
Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
3599-PPCDT
Número da atribuição
JPND-PS/0001/2013