Toxoplasma gondii Tubulin Cofactor B plays a key role in host cell invasion and replication

Abstract

Tubulin cofactors participate in the folding, dimerization, and dissociation pathways of the tubulin dimer, being implicated in the control of tubulin proteostasis and consequently in the control of microtubule (MT) dynamics in vivo. We hypothesise that these proteins have a role in the regulation of MT cytoskeleton dynamics during Toxoplasma gondii host cell invasion. In this context, we characterized the Tubulin cofactor B (TBCB) in T. gondii. TBCB is a CAPGly domain-containing protein that together with TBCE, interact with and dissociate the tubulin dimer. The TBCB sub-cellular localization in T. gondii was studied using an in-house anti-TBCB serum. T. gondii lines overexpressing TBCB were obtained by random integration as well as TBCB conditional knockout lines by CRISPR/Cas9 system. TBCB transgenic clones were characterized by growing assays (plaque, invasion, replication and egress assays), western blot analysis and fluorescence microscopy (standard, confocal and super-resolution). TBCB showed a polarized localization, at the anterior region of the parasite, under the conoid and in close association with polar ring and subpellicular MTs. It did not present a clear co-localization with the apical complex secretory vesicles, although the interaction with rhoptries and micronemes cannot be excluded. TBCB overexpression lines showed a significant decrease in the capacity to form plaques, attributable to a proportional reduction in the capacity to invade. No differences were observed in replication and egress assays. The TgTBCB knockout line, showed a complete depletion of the protein and a viability no longer than a week. These lines showed a strong reduction in their capacity to invade the host cell and in their replication rate. In the absence of TBCB, cells have an altered axis of division resulting in abnormal division. Some parasites show the loss of the correct division axis and some parasites have four daughter cells forming inside instead of two. TBCB is a polarity marker in T. gondii and is involved in the invasion and replication processes. Its apical localization, together with TBCB mammalian partners already described (MT associated proteins) and the invasion phenotypes, suggest that TBCB can be involved in the intracellular traffic of secretory vesicles depending on MTs. Importantly, TBCB is an essential protein, constituting a good target for new control strategies.

RESUMO - O Cofactor B da Tubulina de Toxoplasma gondii tem um papel central na invasão da célula hospedeira e na replicação - Os parasitas protozoários pertencentes ao Filo Apicomplexa são agentes patogénicos responsáveis por um vasto leque de doenças. Apesar da grande biodiversidade deste filo, os mecanismos moleculares adjacentes ao processo de invasão das células hospedeiras parecem ser conservados entre as diferentes espécies. O processo de invasão das células hospedeiras tem gerado grande interesse em vários grupos, incluindo o nosso, visto ser um importante alvo para o delineamento de estratégias médicas profilácticas e terapêuticas. Assim, nos últimos anos o nosso grupo tem vindo a interessar-se pelo estudo e compreensão do envolvimento do citoesqueleto de microtúbulos, tanto do parasita como da célula hospedeira, no processo de invasão. Os nossos resultados anteriores em Besnoitia besnoiti mostraram que este parasita, aquando da interação com a célula hospedeira, sofre alterações dramáticas na sua forma e superfície, acompanhadas pela remodelação de estruturas específicas de microtúbulos (MTs), nomeadamente os MTs subpeliculares. Estas alterações foram evidenciadas através de uma marcação distinta da tubulina na zona posterior do parasita. Para além disso, o citoesqueleto de MTs da célula hospedeira também responde à entrada do parasita, resultados que, posteriormente, foram também obtidos em Toxoplasma gondii. Estudos anteriores em T. gondii demonstraram que os MTs subpeliculares são muito estáveis. Esta estabilidade está possivelmente relacionada com modificações pós-traducionais (MPT) da tubulina, uma vez que, ao contrário dos vertebrados, estes organismos possuem uma família multigénica de α- e β-tubulinas composta por um número reduzido de membros. As MPTs referidas parecem modelar a interação dos MTs com as proteínas que lhes estão associadas. Mais ainda, em T. gondii, foram descritas proteínas que cobrem os MTs, num padrão complexo e definido, e que são importantes para a estabilidade dos mesmos. Deste modo, as proteínas que interagem com os MTs podem desempenhar um papel crucial na regulação do citoesqueleto do parasita aquando da invasão da célula hospedeira. Outras proteínas importantes para a regulação da dinâmica do citoesqueleto de MTs são os cofactores da tubulina, os quais participam nas vias de “folding”, dimerização e dissociação do dímero de tubulina. Estes cofatores controlam a proteostase da tubulina, através do controlo da “pool” de tubulina solúvel, participando na regulação da dinâmica dos MTs in vivo. Consequentemente, estas proteínas são candidatas a desempenhar um papel crucial nas modificações observadas no citoesqueleto de MTs do parasita aquando da invasão da célula hospedeira. Neste contexto o nosso objetivo principal foi avaliar e caracterizar o papel do Cofator B da Tubulina (TBCB de “Tubulin-binding cofactor B”) em T. gondii. Esta é uma proteína relativamente pequena que possui um domínio CAP-Gly na sua extremidade C-terminal e um domínio semelhante à ubiquitina (UBL de “ubiquitin-like”) na extremidade N-terminal. Em conjugação com o Cofactor E da tubulina (TBCE de “Tubulin binding cofactor E”), o TBCB dissocia o dímero de tubulina, controlando desta forma a “pool” de tubulina solúvel disponível na célula e consequentemente a dinâmica do citoesqueleto de MTs. A escolha do parasita protozoário T. gondii como modelo biológico deve-se ao facto de o mesmo possuir um genoma totalmente sequenciado e bem anotado, juntamente com o vasto conjunto de ferramentas disponíveis para a sua manipulação genética. Neste trabalho identificámos o gene do Tbcb em T. gondii, analisámos os níveis de expressão por RT-PCR durante o processo de invasão da célula hospedeira e de replicação, estudámos a localização intracelular do TgTBCB usando um anticorpo produzido no nosso laboratório e recorrendo a microscopia confocal e de super resolução, examinámos o fenótipo de TBCB em excesso (sobre-expressão por integração ao acaso) e de ausência do TBCB (deleção do gene utilizando o sistema CRISPR/Cas9). Nestes dois últimos casos foram criadas e selecionadas linhas transgénicas de parasitas, as quais foram analisadas em ensaios de crescimento (formação de pacas, invasão, replicação e egresso) bem como por western blot e por microscopia de fluorescência. Da análise dos níveis da expressão do Tbcb de T. gondii durante o processo de invasão e de replicação do parasita na célula hospedeira, notámos uma diminuição significativa dos níveis de expressão às 4 horas após a invasão da célula hospedeira, à qual se seguiu uma fase de recuperação desses níveis. Quanto à localização sub-celular do TgTBCB, observámos que em T. gondii esta proteína tem uma localização polarizada, estando localizada essencialmente no polo anterior, junto do conoide, podendo, por vezes, ser também observada uma marcação menos abundante no polo posterior. Constatámos ainda que o TgTBCB co-localiza parcialmente com as proteínas 2 e 3 das micronemas e com a tubulina glutamilada. Foi ainda possível constatar que na região apical o TBCB em T. gondii parece co-alinhar com os MTs subpeliculares, MTs que afunilam para estarem ancorados ao anel polar. Desta forma, o TBCB também parece estar junto ou imediatamente abaixo ao anel polar apical. Observámos que o excesso de TgTBCB causa uma queda acentuada na capacidade de formar placas de lise em tapetes celulares, a qual foi acompanhada de forma proporcional por uma diminuição notória dos níveis de invasão de células pelos parasitas. Curiosamente, não verificámos qualquer alteração na replicação ou no egresso dos mesmos. Em relação à deleção do gene Tbcb do parasita, 72 horas após a indução da CRISPR/Cas9 comprovámos a completa ausência de TgTBCB por western blot. Observámos também que a viabilidade dos parasitas sem TgTBCB não supera uma semana e que após a indução da deleção do gene, os parasitas demonstraram uma enorme redução na capacidade de invasão e também de replicação. Isto é, os poucos parasitas que conseguiam invadir as células hospedeiras apresentavam enormes problemas na replicação. Por western blot, nos extratos proteicos insolúveis, notámos uma diminuição nos níveis de a-tubulina, tubulina acetilada e poliglutamilada. Estes resultados também foram confirmados por imunofluorescência. Constatámos ainda que os parasitas sem TgTBCB apresentavam vários problemas de divisão, entre eles a alteração do eixo de divisão, a perda do controlo da divisão e a formação de células com morfologia arredondada, compatível com a perda de polaridade. Por microscopia eletrónica observámos também a perda de polaridade dos parasitas bem como a presença de núcleos de dimensões muito superiores ao normal ou dois núcleos dentro da célula, sem que a divisão celular tivesse sido concluída. Concluindo, o TgTBCB é uma proteína com uma localização polar, sendo observada no polo anterior abaixo do conoide e junto ao anel apical polar, acompanhado os MTs subpeliculares na região apical. A sua co-localização parcial com as proteínas das micronemas e com os MTs subpeliculares, bem como os seus parceiros já descritos em células de mamífero (proteínas de ligação aos MTs), juntamente com o fenótipo de invasão, sugerem que esta proteína em T. gondii poderá estar envolvida no tráfego vesicular ao longo dos MTs subpeliculares. A sobre-expressão do TgTBCB demonstrou a importância desta proteína no processo de invasão e a sua deleção provou que é essencial quer para a invasão quer para a replicação do parasita, visto que na ausência de TgTBCB há um comprometimento irreversível do citoesqueleto de MTs do parasita, levando à morte em menos de uma semana. Este fenótipo, aparentemente, está associado à diminuição dos MTs subpeliculares bem como à impossibilidade de formar novos MTs nas células filhas. Em suma, o TgTBCB é uma proteína essencial em T. gondii, podendo constituir um novo potencial alvo para novas estratégias de controlo e tratamento do parasita.