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Publicação
The dual role of enterococci in food technology: bacteriocin production versus pathogenicity potential
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Orientador(es)
Resumo(s)
Enterococci are usually isolated from fermented foods, in which they contribute to the ripening/organoleptic characteristics, but nowadays are considered emerging pathogens, due to an increase of antibiotic resistances and production of virulence traits. Although enterococcal foodborne infections have not been described so far, this combination of factors raises special awareness regarding the food safety of products harboring enterococci. The present study analyzed Portuguese traditional meat fermented products namely, Catalão, Chouriço Preto, Linguiça, Paio and Salsichão, for the presence of Enterococcus spp., focusing on their technological interest and pathogenicity potential. 148 enterococci were presumptively identified at genus level by growth in selective media, at different temperatures, pH values, NaCl concentrations and assessment of Gram-staining, catalase and oxidase activities. Subsequently, the genomic diversity of the isolates was assessed by PCR-fingerprinting with primers OPC-19 and (GTG)5 and calculation of Simpson‘s diversity index (D=0.927). Analysis of the dendrogram obtained led to the selection of 75 meat-enterococci, representative of all enterococcal groups, which were identified by multiplex-PCR as members of the species Enterococcus faecalis (n=45), E. faecium (n=22) and E. durans (n=8). To evaluate technological potential the meat-enterococci were tested for the production of bacteriocins and enzymes of technological relevance: 8% produced bacteriocins and several enzymatic activities were observed (e.g acid phosphatase, cystine arylamidase, lipase and casein). Subsequently, the meat-enterococci were evaluated for the presence of virulence factors: Genes agg, esp and cylA were absent and the most frequent virulence determinants were ebpC 28%, epa 28% and gelE 75%. Ten of the isolates produced gelatinase and none is β-hemolytic. The isolates were also tested for biofilm production with 39% being considered strong biofilm producers. The strains were also evaluated for their susceptibility to fourteen antibiotics. All the meat-enterococci were found to be resistant to cefalexin, nalidixic acid, streptomycin and sulphamethoxazol/trimethropim and susceptible to ampicillin, amoxycillin/clavulanate and high level gentamicin. For the remaining agents the following resistances were observed: 3% for chloramphenicol,12% for erythromycin, 71% for gentamicin-10, 36% for penicillin G, 60% for tetracycline and 20% for vancomycin (of which 5 isolates were found to be resistant to high levels MIC>256µg/ml). Overall, even thought the meat enterococci present several antibiotic resistances and produce biofilms, due to a low number of virulence factors and to the absence of reports regarding foodborne infections, a low risk is probably associated with the presence of enterococci in these long-established traditional meat fermented products.
Os enterococcos são encontrados numa grande variedade de ambientes, tal como em águas ou no solo. Estas bactérias ubíquas fazem parte da microbiota autóctone do tracto gastrointestinal do Homem e diferentes animais de sangue quente (Murray, 1990; Klein, 2003). São ainda frequentemente encontrados em alimentos fermentados, como produtos lácteos e carnes (Franz et al.,1999; Hugas et al., 2003). Actualmente, os enterococos são considerados como patogénicos emergentes, devido à sua elevada resistência a antibióticos e produção de factores de virulência (Semedo-Lemsaddek e Mato, 2011). Embora até este momento não tenham sido descritas toxinfecções causadas por enterococos, esta combinação de factores levanta sérias questões de segurança alimentar, especialmente para os produtos a que os enterococcos estão associados. Em Portugal, bem como noutros países mediterrâneos, o fabrico e consumo de enchidos tradicionais é muito frequente (Barbosa et al., 2009; Ribeiro et al., 2011). Assim, uma vez que os enterococos são frequentemente encontrados em produtos cárneos fermentados, torna-se importante perceber qual a sua frequência nestes produtos e que tipo de potencial patogénico os isolados alimentares apresentam. A patogenicidade dos enterococos é atribuída à presença/expressão de diversos factores de virulência (e.g. agg, efaAfs, esp, gelE, cylA, epa e fsrABC) bem como à resistência (intrínseca ou adquirida) a vários antibióticos. Ainda relacionado com o potencial patogénico, encontra-se a capacidade de produção de biofilmes. Estas formas de resistência ambiental podem permitir a permanência de microrganismos no ambiente fabril, facilitanto o seu estabelecimento nos produtos e a sua disseminação para os consumidores através da cadeia alimentar (Paganelli and Leavis, 2011). Por outro lado, muitas das características organolépticas dos produtos fermentados são atribuídas à fermentação levada a cabo pelas bactérias lácticas, entre elas aos enterococos (Giraffa, 2002). Deste modo, torna-se também importante perceber qual o interesse para a tecnologia alimentar que os enterococos presentes nos enchidos podem apresentar (que tipo de enzimas produzem; se produzem bacteriocinas; quais são e qual o seu espectro de acção). Neste estudo, a presença de Enterococcus spp. foi analisada em vários produtos cárneos fermentados Portugueses fabricados de forma tradicional. Nomeadamente, Catalão, Chouriço Preto, Linguiça, Paio e Salsichão. No total, foram isolados 148 enterococos de todos os produtos analisados, tendo os mesmos sido presuntivamente identificados ao nível de género através de uma bateria de testes fenotípicos que incluiram o crescimento em dois meios selectivos (Slanetz and Bartley agar e Bílis Esculina Azida agar), a diferentes temperaturas (10, 37 e 45ºC), a pH elevado (9,6) e em presença de concentrações salinas de 6,5%, coloração de Gram, teste de actividade da catalase e oxidase. Paralelamente, para uma identificação mais fidedigna a nível de género, foi ainda efectuado um PCR dirigido para sequências específicas do género Enterococcus (Ke et al., 1999). De seguida, a diversidade da colecção de isolados de enchidos foi avaliada por PCR-fingerprinting utilizando dois primers aleatórios OPC19 e (GTG)5. Com os perfis de bandas obtidos foi construído um dendrograma, a partir do qual foi possível efectuar a selecção de 75 enterococos, representando todos os grupos, para estudos posteriores. Foi ainda calculado o índice de diversidade de Simpson (D=0.927). Procedeu-se então á identificação dos isolados ao nível de espécie; tendo os mesmos sido incluídos nas espécies Enterococcus faecalis (n=45), E. faecium (n=22) e E. durans (n=8). Subsequentemente foi avaliada a susceptibilidade dos isolados a catorze antibióticos, representando oito classes diferentes, por difusão em placa, segundo os critérios do CLSI (2008). O fenótipo de resistência observado foi o seguinte: 1% (1/75) para a ampicilina, 1% (1/75) para a amoxicilina/ácido clavulâmico, 100% (75/75) para cefalexima, 76% (57/75) para a cefotaxima, 3% (2/75) para o cloranfenicol, 12% (9/78) para a eritromicina, 71% (53/75) para a gentamicina-10, 0% (0/75) para a gentamicina-120, 100% (75/75) para o ácido nalidixico, 36% (27/75) para a penicilina G, 100% (75/75) para a estreptomicina, 100% (75/75) para o sulfametoxazol/trimetropim, 60% (45/75) para a tetraciclina e 20% (15/75) para a vancomicina. Seguindo as recomendações do CLSI (2008), para as estirpes de enterococos resistentes à vancomicina, foi ainda avaliada a concentração mínima inibitória (MIC), tendo cinco das estirpes sido classificadas como resistentes a elevados níveis de deste antibiótico (MIC>256 g/ml). Para os isolados em que foram observadas resistências nos testes de difusão em placa efectuou-se ainda a pesquisa de genes de resistência por PCR: para a tetraciclina o gene tet(M), para a eritromicina o gene erm(B) e para a vancomicina os genes vanA e vanB. Nas estirpes resistentes à eritromicina 78% foi positiva para a presença do gene erm(B); nas estirpes resistentes à tetraciclina, 65% foi positivo para a presença do gene tet(M); e nas estirpes vancomicina resistentes, nenhuma foi positiva para o gene vanA e apenas uma foi positiva para o gene vanB. Tendo em conta estes resultados, todos os enterococos de enchidos tradicionais Portugueses foram classificados como multi-resistentes, ou seja, todos apresentam resistência a pelo menos um agente de três ou mais classes de antibióticos (Magiorakos et al., 2011). Estes elevados níveis de resistência observados são motivo de preocupação, especialmente os elevados níveis de resistência à vancomicina, um medicamento de último recurso no tratamento de infecções potencialmente fatais provocadas por enterococos. As estirpes de enterococos isoladas de carnes foram ainda avaliadas quanto à presença de genes que codificam factores de virulência, por PCR. Nomeadamente, substancia de agregação (agg), proteína de superfície (enterococcal surface protein –esp), adesinas (adhesin-like E. faecalis endocarditis antigen -efaAfs), pili (endocarditis/biofilm-associated pilus –ebpABC), polissacarídeo de parede (enterococcal polysaccharide antigen gene –epa), citolisina/hemolisina (cyl) e a enzima hidrolítica gelatinase (gelE). Foram ainda efectuados testes em placa para pesquisa da actividade hemolítica e da gelatinase. Os resultados observados para os PCRs de virulência foram os seguintes 5% (4/75) das estirpes positivas para o gene ebpA, 19% (14/75) para o gene ebpB, 28% (21/75) para o gene ebpC, 17% (13/75) para o gene efaAfs, 28% (21/75) para o gene epa, 25% (19/75) para o gene fsrB (parte do operão da gelatinase) e 75% (56/75) para o gene gelE. Os genes agg, esp e cylA não foram encontrados em nenhuma das estirpes em análise. Em relação aos testes em placa, 10 estirpes foram classificadas como produtoras de gelatinase (13%) e nenhuma foi considerada β-hemolitica. As estirpes de enterococos foram também testadas quanto à sua capacidade de produção de biofilmes, tendo sido classificadas em quatro classes diferentes: 8% como não produtoras (6/75); 28% como fracas produtoras (21/75); 25% como produtoras moderadas (19/75); e 39% como fortes produtoras (29/75). Finalmente, as estirpes de enterococos foram ainda avaliadas quanto ao seu potencial tecnológico, mais precisamente quanto à capacidade de produção de bacteriocinas e actividades enzimáticas (e.g. fosfatase ácida, fosfatase alcalina, entre outras). Apenas 8% (5/75) das estirpes apresentaram potencial bactericinogénico. Após amplificação por PCR apenas foi possível identificar os genes estruturais das bacteriocinas em duas destas estirpes, correspondendo à enterocina A e enterocina B. Algumas estirpes apresentaram potencial tecnológico, uma vez que têm capacidade de produção de bacteriocinas e largo espectro enzimático. Contudo, o tipo de aborgadem utilizada neste estudo permitiu perceber que não são passeiveis de serem utilizadas em tecnologia alimentar, uma vez que também apresentam variadas resistências a antibióticos bem como alguns factores de virulência. Uma forma de ultrapassar este facto seria a utilização de extractos purificados de bacteriocinas bem como de enzimas. Em conclusão, apesar do enterococos isolados de produtos cárneos tradicionais Portugueses apresentarem várias resistências a antibióticos e capacidade de formação de biofilmes, uma vez que estão associados a uma baixa frequência de factores de virulência, um baixo risco parece estar associado ao consumo destes produtos.
Os enterococcos são encontrados numa grande variedade de ambientes, tal como em águas ou no solo. Estas bactérias ubíquas fazem parte da microbiota autóctone do tracto gastrointestinal do Homem e diferentes animais de sangue quente (Murray, 1990; Klein, 2003). São ainda frequentemente encontrados em alimentos fermentados, como produtos lácteos e carnes (Franz et al.,1999; Hugas et al., 2003). Actualmente, os enterococos são considerados como patogénicos emergentes, devido à sua elevada resistência a antibióticos e produção de factores de virulência (Semedo-Lemsaddek e Mato, 2011). Embora até este momento não tenham sido descritas toxinfecções causadas por enterococos, esta combinação de factores levanta sérias questões de segurança alimentar, especialmente para os produtos a que os enterococcos estão associados. Em Portugal, bem como noutros países mediterrâneos, o fabrico e consumo de enchidos tradicionais é muito frequente (Barbosa et al., 2009; Ribeiro et al., 2011). Assim, uma vez que os enterococos são frequentemente encontrados em produtos cárneos fermentados, torna-se importante perceber qual a sua frequência nestes produtos e que tipo de potencial patogénico os isolados alimentares apresentam. A patogenicidade dos enterococos é atribuída à presença/expressão de diversos factores de virulência (e.g. agg, efaAfs, esp, gelE, cylA, epa e fsrABC) bem como à resistência (intrínseca ou adquirida) a vários antibióticos. Ainda relacionado com o potencial patogénico, encontra-se a capacidade de produção de biofilmes. Estas formas de resistência ambiental podem permitir a permanência de microrganismos no ambiente fabril, facilitanto o seu estabelecimento nos produtos e a sua disseminação para os consumidores através da cadeia alimentar (Paganelli and Leavis, 2011). Por outro lado, muitas das características organolépticas dos produtos fermentados são atribuídas à fermentação levada a cabo pelas bactérias lácticas, entre elas aos enterococos (Giraffa, 2002). Deste modo, torna-se também importante perceber qual o interesse para a tecnologia alimentar que os enterococos presentes nos enchidos podem apresentar (que tipo de enzimas produzem; se produzem bacteriocinas; quais são e qual o seu espectro de acção). Neste estudo, a presença de Enterococcus spp. foi analisada em vários produtos cárneos fermentados Portugueses fabricados de forma tradicional. Nomeadamente, Catalão, Chouriço Preto, Linguiça, Paio e Salsichão. No total, foram isolados 148 enterococos de todos os produtos analisados, tendo os mesmos sido presuntivamente identificados ao nível de género através de uma bateria de testes fenotípicos que incluiram o crescimento em dois meios selectivos (Slanetz and Bartley agar e Bílis Esculina Azida agar), a diferentes temperaturas (10, 37 e 45ºC), a pH elevado (9,6) e em presença de concentrações salinas de 6,5%, coloração de Gram, teste de actividade da catalase e oxidase. Paralelamente, para uma identificação mais fidedigna a nível de género, foi ainda efectuado um PCR dirigido para sequências específicas do género Enterococcus (Ke et al., 1999). De seguida, a diversidade da colecção de isolados de enchidos foi avaliada por PCR-fingerprinting utilizando dois primers aleatórios OPC19 e (GTG)5. Com os perfis de bandas obtidos foi construído um dendrograma, a partir do qual foi possível efectuar a selecção de 75 enterococos, representando todos os grupos, para estudos posteriores. Foi ainda calculado o índice de diversidade de Simpson (D=0.927). Procedeu-se então á identificação dos isolados ao nível de espécie; tendo os mesmos sido incluídos nas espécies Enterococcus faecalis (n=45), E. faecium (n=22) e E. durans (n=8). Subsequentemente foi avaliada a susceptibilidade dos isolados a catorze antibióticos, representando oito classes diferentes, por difusão em placa, segundo os critérios do CLSI (2008). O fenótipo de resistência observado foi o seguinte: 1% (1/75) para a ampicilina, 1% (1/75) para a amoxicilina/ácido clavulâmico, 100% (75/75) para cefalexima, 76% (57/75) para a cefotaxima, 3% (2/75) para o cloranfenicol, 12% (9/78) para a eritromicina, 71% (53/75) para a gentamicina-10, 0% (0/75) para a gentamicina-120, 100% (75/75) para o ácido nalidixico, 36% (27/75) para a penicilina G, 100% (75/75) para a estreptomicina, 100% (75/75) para o sulfametoxazol/trimetropim, 60% (45/75) para a tetraciclina e 20% (15/75) para a vancomicina. Seguindo as recomendações do CLSI (2008), para as estirpes de enterococos resistentes à vancomicina, foi ainda avaliada a concentração mínima inibitória (MIC), tendo cinco das estirpes sido classificadas como resistentes a elevados níveis de deste antibiótico (MIC>256 g/ml). Para os isolados em que foram observadas resistências nos testes de difusão em placa efectuou-se ainda a pesquisa de genes de resistência por PCR: para a tetraciclina o gene tet(M), para a eritromicina o gene erm(B) e para a vancomicina os genes vanA e vanB. Nas estirpes resistentes à eritromicina 78% foi positiva para a presença do gene erm(B); nas estirpes resistentes à tetraciclina, 65% foi positivo para a presença do gene tet(M); e nas estirpes vancomicina resistentes, nenhuma foi positiva para o gene vanA e apenas uma foi positiva para o gene vanB. Tendo em conta estes resultados, todos os enterococos de enchidos tradicionais Portugueses foram classificados como multi-resistentes, ou seja, todos apresentam resistência a pelo menos um agente de três ou mais classes de antibióticos (Magiorakos et al., 2011). Estes elevados níveis de resistência observados são motivo de preocupação, especialmente os elevados níveis de resistência à vancomicina, um medicamento de último recurso no tratamento de infecções potencialmente fatais provocadas por enterococos. As estirpes de enterococos isoladas de carnes foram ainda avaliadas quanto à presença de genes que codificam factores de virulência, por PCR. Nomeadamente, substancia de agregação (agg), proteína de superfície (enterococcal surface protein –esp), adesinas (adhesin-like E. faecalis endocarditis antigen -efaAfs), pili (endocarditis/biofilm-associated pilus –ebpABC), polissacarídeo de parede (enterococcal polysaccharide antigen gene –epa), citolisina/hemolisina (cyl) e a enzima hidrolítica gelatinase (gelE). Foram ainda efectuados testes em placa para pesquisa da actividade hemolítica e da gelatinase. Os resultados observados para os PCRs de virulência foram os seguintes 5% (4/75) das estirpes positivas para o gene ebpA, 19% (14/75) para o gene ebpB, 28% (21/75) para o gene ebpC, 17% (13/75) para o gene efaAfs, 28% (21/75) para o gene epa, 25% (19/75) para o gene fsrB (parte do operão da gelatinase) e 75% (56/75) para o gene gelE. Os genes agg, esp e cylA não foram encontrados em nenhuma das estirpes em análise. Em relação aos testes em placa, 10 estirpes foram classificadas como produtoras de gelatinase (13%) e nenhuma foi considerada β-hemolitica. As estirpes de enterococos foram também testadas quanto à sua capacidade de produção de biofilmes, tendo sido classificadas em quatro classes diferentes: 8% como não produtoras (6/75); 28% como fracas produtoras (21/75); 25% como produtoras moderadas (19/75); e 39% como fortes produtoras (29/75). Finalmente, as estirpes de enterococos foram ainda avaliadas quanto ao seu potencial tecnológico, mais precisamente quanto à capacidade de produção de bacteriocinas e actividades enzimáticas (e.g. fosfatase ácida, fosfatase alcalina, entre outras). Apenas 8% (5/75) das estirpes apresentaram potencial bactericinogénico. Após amplificação por PCR apenas foi possível identificar os genes estruturais das bacteriocinas em duas destas estirpes, correspondendo à enterocina A e enterocina B. Algumas estirpes apresentaram potencial tecnológico, uma vez que têm capacidade de produção de bacteriocinas e largo espectro enzimático. Contudo, o tipo de aborgadem utilizada neste estudo permitiu perceber que não são passeiveis de serem utilizadas em tecnologia alimentar, uma vez que também apresentam variadas resistências a antibióticos bem como alguns factores de virulência. Uma forma de ultrapassar este facto seria a utilização de extractos purificados de bacteriocinas bem como de enzimas. Em conclusão, apesar do enterococos isolados de produtos cárneos tradicionais Portugueses apresentarem várias resistências a antibióticos e capacidade de formação de biofilmes, uma vez que estão associados a uma baixa frequência de factores de virulência, um baixo risco parece estar associado ao consumo destes produtos.
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
Palavras-chave
Microbiologia aplicada Enterococos Antibióticos Biofilmes Indústria alimentar Biologia molecular Teses de mestrado - 2011