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Publicação
Dissecting the role of peripheral glia in neuronal development, plasticity and after injury in Drosophila
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
O sistema nervoso periférico humano (SNP) é composto por nervos cranianos e espinhais que contêm os
axónios dos neurónios sensoriais e motores, e são responsáveis pela inervação da musculatura e dos órgãos
de todo o corpo, assim como pelo processamento de estímulos sensoriais da periferia para o cérebro. Para tal,
o SNP depende da relação interdependente entre neurónios e células da glia, embora os mecanismos celulares
e moleculares subjacentes a essas interações dinâmicas na periferia ainda não tenham sido totalmente
desvendados.
Este trabalho tem como objetivo a obtenção de conhecimento básico sobre a influência da glia periférica na
plasticidade e regeneração de neurónios motores e sensoriais. Como a complexidade do sistema nervoso de
mamíferos apresenta diversos desafios para o estudo do SNP, desenvolvemos este trabalho na mosca-da-fruta
Drosophila melanogaster, um modelo invertebrado mais simples. Ao longo das últimas décadas, este
organismo tem sido fundamental para o estudo de diversos processos moleculares e celulares, uma vez que
65% dos genes que causam doenças em humanos têm um homólogo funcional na Drosophila.
As células da glia periférica da Drosophila têm origem em progenitores do sistema nervoso central (SNC) e
migram ao longo de projeções axonais de neurónios motores e sensoriais para as suas posições na periferia.
À semelhança dos vertebrados, em Drosophila, as células da glia são cruciais para o estabelecimento da
barreira hematoencefálica, isolamento neuronal e para a orientação do cone de crescimento de neurónios
sensoriais e motores durante o desenvolvimento do SNP. Presentemente, existem três tipos de glia definidos
morfologicamente no SNP da Drosophila – wrapping glia (exclusivas da periferia), subperineurial glia e
perineurial glia (ambas comuns ao CNS e ao SNP). A identificação de vários elementos promotores e
marcadores moleculares possibilita a identificação e manipulação dos vários tipos de glia em Drosophila,
permitindo dissecar funções da glia no contexto do desenvolvimento, plasticidade e regeneração neuronal no
SNP.
Durante o desenvolvimento, a morfologia e função dos neurónios são geneticamente programadas, contudo
podem ser remodeladas em resposta a alterações nos níveis de atividade, um processo denominado
plasticidade. Contudo, os mecanismos de plasticidade, nomeadamente em relação à contribuição da glia,
ainda não são totalmente conhecidos. Um dos modelos usados para estudar a plasticidade sináptica e neuronal
é a junção neuromuscular da Drosophila, uma sinapse química formada entre um neurónio motor e as fibras
musculares. Semelhante às sinapses centrais de vertebrados, a junção neuromuscular da Drosophila é
composta por dois compartimentos, um pré-sináptico e um pós-sináptico. Os terminais pré-sinápticos dos
neurónios são constituídos por varicosidades redondas chamadas botões sinápticos, onde a transmissão
nervosa ocorre. Estas estruturas são altamente dinâmicas e estruturalmente plásticas, alterando o seu tamanho
e número em resposta a modificações na atividade. Os botões sinápticos recém-formados não possuem
maquinaria de transmissão pós-sináptica e designam-se por ghost boutons, podendo a rápida adição de botões
pré-sinápticos ser induzida em resposta a determinados padrões de atividade utilizando uma variedade de
estímulos (solução com K+ elevado, atividade elétrica e optogenética).
Este trabalho tem como um de seus propósitos conhecer a influência dos vários subtipos de glia na
plasticidade de neurónios motores. Para tal, expressámos especificamente um gene regulador de apoptose
especificamente nos diferentes subtipos de glia e induzimos plasticidade estrutural aguda na junção
neuromuscular no terceiro estádio larvar da Drosophila, utilizando um protocolo de despolarização espaçada
usando uma solução com K+ elevado. A observação de novos botões foi efetuada através de microscopia
confocal em amostras fixadas de forma a extrair informação quantitativa.
Os resultados sugerem que não existem diferenças estatísticas significativas no número de ghost boutons na
junção neuromuscular dos músculos 6/7 da larva quando a wrapping glia é geneticamente removida desde a
embriogénese do organismo em comparação com larvas selvagens/wild type. Isto sugere que a ausência da
wrapping glia desde as fases mais precoces de desenvolvimento não impacta o normal desenvolvimento e plasticidade estrutural dos neurónios motores. Por outro lado, ao replicarmos o mesmo protocolo de apoptose
geneticamente induzida da subperineurial glia, descobrimos que as larvas não sobrevivem quando
removemos este subtipo de glia durante o desenvolvimento inicial. Estas observações demonstram o papel
fulcral da subperineurial glia no desenvolvimento. Ao induzirmos a morte celular mais tarde no
desenvolvimento, no início do terceiro estádio larvar, as larvas sobrevivem, permitindo a análise da
plasticidade estrutural. Verificámos que a ausência de subperineurial glia também não leva a uma alteração
significativa no número de ghost boutons na junção neuromuscular. Assim, os nossos resultados sugerem
que tanto as wrapping glia como as subperineurial glia não influenciam a plasticidade dos neurónios
motores.
Outro dos objetivos principais deste trabalho consiste na elucidação da influência da glia na regeneração
neuronal. Na pele, os neurónios sensoriais estão em contacto com a epiderme para assegurar a transmissão
de sensações mecânicas, térmicas e de dor. Estes neurónios encontram-se cobertos por células da glia,
responsáveis por lhes fornecer suporte nutricional e estrutural. Quando acontece uma lesão na epiderme, as
células epiteliais, os neurónios sensoriais e a glia têm de trabalhar colaborativamente para restabelecer a
inervação do tecido. Contudo, os mecanismos usados pela glia para regular a reparação de tecidos
permanecem, na sua maioria, desconhecidos. Adicionalmente, não é claro se as células da glia são capazes
de regenerar após uma lesão. Os Class IV dendritic arborisation neurons (c4da) são neurónios sensoriais do
SNP da Drosophila que cobrem a totalidade da superfície da larva, contactando diretamente a epiderme e
constituindo os nociceptores primários da larva. Vários grupos já reportaram que os neurónios c4da têm uma
capacidade robusta de regeneração dendrítica após uma lesão, assim como de recuperação da capacidade de
resposta a estímulos mecânicos do meio exterior. Os somas destes neurónios são cobertos por células da glia
e as suas dendrites contactam diretamente a epiderme da larva.
O trabalho previamente realizado no nosso laboratório estabeleceu um ponto de partida para o uso da
epiderme larvar da Drosophila como um modelo para explorar a dinâmica entre a epiderme e o sistema
nervoso sensorial, assim como as funções desempenhadas por cada intermediário in vivo. Deste modo, aqui,
pretendemos explorar a dinâmica da regeneração neuronal e da glia, induzindo lesões que afetam
simultaneamente a epiderme, neurónio e glia da larva. Deste modo procurámos determinar se uma lesão na
glia poderá afetar a capacidade regenerativa do neurónio sensorial adjacente, assim como se a glia recupera
após esta lesão.
Os resultados preliminares sugerem que quando a lesão atinge a glia, as dendrites lesionadas não regeneraram
tão robustamente em comparação com as larvas nas quais a lesão atinge apenas as dendrites e a epiderme,
mas deixando a glia intacta. Observámos ainda que as ramificações da glia não regeneram após uma lesão
direta na pele da larva, pelo menos até 48 h após a indução da ferida.
Em trabalhos futuros seria crucial confirmar os resultados aqui apresentados aumentando o tamanho da
amostra, assim como delinear metodologias experimentais que permitam adicionalmente a exploração dos
mecanismos moleculares e vias de sinalização que participam na comunicação glia-neurónio durante os
processos de plasticidade e regeneração neuronal. Seria também pertinente investigar especificamente as
funções da perineurial glia, não contemplada neste trabalho, provavelmente o subtipo de glia da Drosophila
de que menos se sabe.
A investigação de processos celulares em modelos como a Drosophila é fundamental para aprofundar o
conhecimento da biologia da glia e as suas interações com os neurónios, que por sua vez contribuirá para
aprimorar o conhecimento relativo ao desenvolvimento e funções desempenhadas pelo sistema nervoso
humano.
Glial cells are crucial for the development and homeostasis of the nervous system, and although we know increasingly more about their roles, several questions remain unanswered. There is still a lot of uncharted territory regarding the functions of different glial types, the molecular and cellular mechanisms underlying glia-neuron interactions, as well as in glial cell plasticity and its impact on neuronal function and regeneration. Here, our goal is to unravel the functional significance of peripheral glia in neuronal repair and structural plasticity. We studied the interactions between neurons and glia in two different contexts of Drosophila melanogaster’s peripheral nervous system – the neuromuscular junction and the sensory nervous system of the larval skin. Through this genetically tractable model, we monitored and manipulated cellular behaviour during development and after injury in vivo. First, to study the role of glia in structural plasticity, we developed a genetically encoded system that allows ablation of specific glial subtypes at different timepoints of Drosophila development. We show that subperineurial glia are required for larval development and survival. Only when we ablated subperineurial glia from early third larval stage, some animals survived. Moreover, through ablation of wrapping glia, we demonstrated that this glia subtype does not appear to cause significant defects in structural plasticity. Regarding sensory nerves, our preliminary findings suggest that sensory neurons do not seem to regenerate as efficiently when glia are wounded, in comparison to when glia are not affected by the wound. This points to a relevant role of glia in sensory neuron dendrite regeneration. Furthermore, glia did not recover their morphology after simultaneous injury of the epithelium, proximal sensory neuron’s dendrites, and glia branches, suggesting that peripheral glial cells are not able regenerate, or regenerate slower. Our findings hint that glia can influence the regeneration of sensory neurons. In contrast, neither subperineurial nor wrapping glia seem to abolish structural plasticity at the NMJ, although subperineurial glia seems to be essential for larval development. This works highlights the complex and diverse roles of peripheral glia during neuronal development and repair, providing an additional steppingstone to uncover conserved processes in vertebrates.
Glial cells are crucial for the development and homeostasis of the nervous system, and although we know increasingly more about their roles, several questions remain unanswered. There is still a lot of uncharted territory regarding the functions of different glial types, the molecular and cellular mechanisms underlying glia-neuron interactions, as well as in glial cell plasticity and its impact on neuronal function and regeneration. Here, our goal is to unravel the functional significance of peripheral glia in neuronal repair and structural plasticity. We studied the interactions between neurons and glia in two different contexts of Drosophila melanogaster’s peripheral nervous system – the neuromuscular junction and the sensory nervous system of the larval skin. Through this genetically tractable model, we monitored and manipulated cellular behaviour during development and after injury in vivo. First, to study the role of glia in structural plasticity, we developed a genetically encoded system that allows ablation of specific glial subtypes at different timepoints of Drosophila development. We show that subperineurial glia are required for larval development and survival. Only when we ablated subperineurial glia from early third larval stage, some animals survived. Moreover, through ablation of wrapping glia, we demonstrated that this glia subtype does not appear to cause significant defects in structural plasticity. Regarding sensory nerves, our preliminary findings suggest that sensory neurons do not seem to regenerate as efficiently when glia are wounded, in comparison to when glia are not affected by the wound. This points to a relevant role of glia in sensory neuron dendrite regeneration. Furthermore, glia did not recover their morphology after simultaneous injury of the epithelium, proximal sensory neuron’s dendrites, and glia branches, suggesting that peripheral glial cells are not able regenerate, or regenerate slower. Our findings hint that glia can influence the regeneration of sensory neurons. In contrast, neither subperineurial nor wrapping glia seem to abolish structural plasticity at the NMJ, although subperineurial glia seems to be essential for larval development. This works highlights the complex and diverse roles of peripheral glia during neuronal development and repair, providing an additional steppingstone to uncover conserved processes in vertebrates.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Regeneração dendrítica Sistema nervoso sensorial Junção neuromuscular Glia Plasticidade Teses de mestrado - 2023