Cellular responses to 3D printed dental resins produced using consumer versus High-End printers

Abstract

Objectives: The aim of this study was to evaluate the influence of different 3D dental printers and resins on human gingival fibroblasts behaviour.

Materials and Methods: Three resins from NextDent (Denture 3D+, C&B MFH and Crowntec) were used to produce disc-shaped specimens on NextDent 5100 and Phrozen Sonic Mini 4K printers, using equivalent parameters in a total of 6 groups (N=20), with groups PD, PC and PT corresponding to Denture 3D+, C&B MFH and Crowntec printed on Phrozen printer, respectively and ND, NC and NT corresponding to Denture 3D+, C&B MFH and Crowntec printed on NexDent printer, respectively . Human gingival fibroblasts were cultured on specimens and biocompatibility evaluated at 1,3 and 7 days. IL-6 and IL-8 concentrations were evaluated at 3 days of culture using ELISA. Surface roughness was evaluated by a contact profilometer. SEM and fluorescence micrographs were analyzed at 1 and 7 days of growth. Statistical analyses were performed using SPSS 28.0 version and mean differences were tested using ANOVA and post-hoc Tukey tests (p< 0.05).

Results: There was an increase in cellular growth after 7 days in culture in group PC and in group PT when compared to group PD (p=0,028 and p=0,203, respectively). ND group resulted in higher concentration of IL-6 when compared to PT group, and NC resulted in higher concentration of IL-8 when compared to ND, NT, PD and PT groups. No significant differences were found between groups regarding surface roughness.

Conclusions: Within the limitations of the present study, NextDent 5100 and Phrozen Sonic Mini 4K performed similarly considering cell responses. The use of different 3D-printing resins influences in-vitro cellular behaviour of human fibroblasts. Surface roughness did not seem to be influenced using different printers or resins, if equivalent parameters are used.

RESUMO A técnica aditiva, também conhecida por impressão 3D, tem ganho popularidade nos últimos anos para produção de próteses removíveis totais, sendo considerada uma alternativa comparável à técnica subtrativa e permite uma relação custo-benefício mais vantajosa, ao requerer equipamentos menos dispendiosos e permitir a confeção de vários objetos simultaneamente. No entanto, está descrita na literatura uma escassez de estudos de biocompatibilidade referentes aos materiais utilizados e aos diferentes métodos de produção. Adicionalmente, apenas existe um estudo que compara a resposta celular a resinas impressas tridimensionalmente com uma impressora recomendada pelo fabricante e uma impressora third- party dispendiosa. Este estudo pretendeu avaliar as respostas celulares às resinas impressas em 3D, utilizando uma impressora recomendada pelo fabricante e uma impressora third-party de menor custo. Tendo em conta que as próteses removíveis estão em íntimo contato com a mucosa, a cultura celular de eleição foram os fibroblastos gengivais humanos, já que são o tipo celular dominante no tecido conjuntivo. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência de diferentes impressoras 3D e resinas no comportamento dos fibroblastos. Como hipótese nula primária, consideramos que o uso de diferentes impressoras 3D com parametrização equivalente não influencia o comportamento celular in vitro de fibroblastos humanos. A hipótese nula secundária considerou que o uso de diferentes resinas não influenciaria o comportamento celular in vitro de fibroblastos humanos. Desta forma, foram selecionadas três resinas para impressão 3D da marca NextDent®, Denture 3D+ na cor Translucent Pink (NextDent®, Soesterberg, Holanda), C&B MFH na cor N1 (NextDent®, Zeist, Holanda) e Crowntec na cor A2 (SAREMCO®, Rebstein, Suíça). Foram selecionadas duas impressoras 3D NextDent 5100 (3D Systems®, Carolina do Sul, Estados Unidos da América) e Phrozen Sonic Mini 4K (Phrozen®, Hsinchu, Taiwan). Durante a utilização das impressoras foram usados parâmetros equivalentes, utilizando uma espessura de 50μm por camada e orientação vertical de impressão. As amostras foram alocadas em 6 grupos, num total de 20 amostras por grupo (N=20). As amostras foram produzidas em forma de disco, com 8mm de diâmetro e 3mm de espessura. Foram seguidas as indicações do fabricante e, após a impressão, foi realizado o protocolo de pós-polimerização, através da lavagem das amostras com etanol a 96% num banho ultrasónico e processo de cura através da NextDent LC-3D Print Box (NextDent®, Soesterberg, Holanda), durante 30 minutos.

Fibroblastos gengivais humanos imortalizados foram cultivados em Dulbecco's Modified Eagle Medium (Lonza, Visp, Suíça), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Biowest, Nuallié, França) e 1% de penicilina/estreptomicina (Lonza, Visp, Suíça). Foram realizados três ensaios (N=15), sendo que em cada ensaio, cinco amostras de cada grupo foram descontaminadas, colocadas em placas de 48 poços (Corning Inc®, Corning®, Nova Iorque, EUA) e semeadas na densidade de 5x103 células por poço. Um controlo negativo consistindo de células na mesma densidade semeadas em poços vazios foi utilizado em todos os ensaios, de modo a validar os ensaios realizados. A viabilidade e proliferação celulares foram avaliadas com o reagente Cell-TiterBlue® (Promega®, Madison, EUA), através da redução de resazurina, conforme o protocolo do fabricante. A taxa de conversão do corante azul não fluorescente foi determinada como intensidade de fluorescência em UA após 1, 3 e 7 dias de cultura, através de um leitor de microplacas multimodo (VICTOR NivoTM HH3500, PerkinElmer®, Pontyclun, Reino Unido). Para quantificar a IL-8 e IL-6 presentes no sobrenadante da cultura celular, foi utilizado o kit Human IL-8 /CXCL8 DuoSet ELISA e o kit Human IL-6 DuoSet ELISA (R&D Systems Inc®, Minneapolis, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, sendo medidos às 72 horas de cultura. A absorvância foi medida utilizando um leitor de microplacas multimodo nos comprimentos de onda de 450nm e 540nm e, com base na curva de calibração, foram calculadas as concentrações de IL-8 e IL-6 em pg/mL. Para avaliar possíveis alterações na morfologia celular foi utilizada a microscopia eletrónica de varrimento (FEG-SEM) e microscopia de fluorescência, sendo que foram descontaminadas 4 amostras de cada grupo, semeadas com HGF-hTERT (nas mesmas condições mencionadas anteriormente) e fixadas com 1 e 7 dias de crescimento. Para microscopia de fluorescência, inicialmente as amostras foram lavadas com PBS filtrado (VWR®, Radnor, Pensilvânia, EUA) e fixadas com formaldeído (Pancreac Applichem, ITW Reagents Division, Darmstadt, Alemanha) a 4% por dez minutos. As células foram então permeabilizadas com 0,10% Triton X-100® (Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) por cinco minutos e foi utilizada uma solução de Faloidina (Phalloidin FITC Reagent – ab235137, Abcam, Waltham, EUA) e uma solução de Iodeto de Propídio (Sigma- Aldrich, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) para colorir o citoplasma e o núcleo, respetivamente. Para FEG-SEM, as amostras foram inicialmente lavadas com PBS e fixadas com glutaraldeído (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Reino Unido) a 2,5% durante uma hora.

Foi realizado o processo de desidratação, utilizando concentrações sucessivamente maiores (de 20 a 100%) de etanol (Honeywell Riedel-de Haën, Seelze, Alemanha). No dia de observação a microscópio, um filme de ouro-paládio (Au-Pd) de 80-20% de massa foi colocado sobre as amostras e estas foram observadas com uma voltagem de aceleração de 10kV com sucessivas ampliações. Para avaliação da rugosidade de superfície, foi realizada perfilometria de contacto, utilizado o Tencor Alpha-step 200 Profilometer, com uma ponta de 12,5μm de diâmetro, a uma distância de 400μm e com uma força de 11mg. A análise estatística foi realizada utilizando IBM SPSS Statistics 28,0 para macOs (SPSS, Chicago, EUA) e GraphPad Prism 9 para macOs (GraphPad Software, Inc. San Diego CA, EUA). A distribuição de normalidade foi avaliada para todas as amostras utilizando o teste de Kolgromov-Smirnov. A comparação entre os grupos foi realizada com base na análise de variância (ANOVA) de uma via, coadjuvante aos testes post-hoc de Tukey. O nível de significância foi definido como p<0,05 e todos os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP). Foi observado um aumento significativo do crescimento celular após 7 dias em cultura no grupo PC (impresso com a resina C&B MFH, pela impressora Phrozen Sonic Mini 4K) e no grupo PT (impresso com a resina Crowntec, pela impressora Phrozen Sonic Mini 4K), quando comparado ao grupo PD (impresso com a resina Denture 3D+, pela impressora Phrozen Sonic Mini 4K) (p=0,028 e p=0,203, respectivamente). Não foram observadas diferenças significativas, em qualquer momento, ao comparar grupos produzidos com a impressora NextDent 5100 e a impressora Phrozen Sonic Mini 4K. Ao comparar a viabilidade celular por resina, foi verificada uma diminuição significativa da viabilidade da resina Denture 3D+, face à resina Crowntec após 1 dia (p<0,001). Ao terceiro e sétimo dia, existiu uma diminuição significativa da viabilidade na resina Denture 3D+, comparativamente à resina C&B MFH (p=0,008 no dia 3 e p=0,002 no dia sete) e Crowntec (p<0,001 no dia 3 e 7). Não foi verificada uma diferença significativa entre as resinas C&B MFH e Crowntec. Relativamente à resposta inflamatória, foi verificada uma maior concentração de IL-6 do grupo ND (impresso com a resina Denture 3D+, pela impressora NextDent 5100) face ao grupo PT. Foi também verificada uma maior concentração de IL-8 do grupo NC (impresso

com a resina C&B MFH, pela impressora NextDent 5100) face aos grupos ND, NT (impresso com Crowntec, pela impressora NextDent 5100), PD e PT. Relativamente à morfologia celular, foi observado que grupo PT apresentava uma maior distribuição e adesão de fibroblastos e que os mesmos apresentavam uma aparência fusiforme. Os fibroblastos existentes nas amostras do grupo PD apresentavam uma aparência mais achatada e estreita, com menos prolongamentos celulares. Relativamente à rugosidade de superfície, não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos. Tendo em conta os resultados deste estudo, é possível concluir que as impressoras NextDent 5100 e Phrozen Sonic Mini 4K apresentaram um desempenho semelhante, considerando as respostas celulares. Desta forma, a hipótese primária nula foi aceite. É possível também concluir que o uso de diferentes resinas influencia o comportamento celular in-vitro de fibroblastos humanos, evidenciado pelas diferenças significativas encontradas nos 3 momentos de viabilidade celular. Desta forma, a hipótese secundária nula foi rejeitada. A resina Denture 3D+ apresentou o pior comportamento celular, sendo que são necessários mais estudos, de modo a determinar se esta resina é compatível com o uso a longo prazo, necessário para a utilização de uma prótese removível. Podemos concluir que a resina C&B MFH promove uma proliferação celular semelhante à resina Crowntec, sendo uma opção menos dispendiosa. Adicionalmente, a rugosidade da superfície não parece ser influenciada pelo uso de diferentes impressoras ou resinas, se forem utilizados parâmetros equivalentes.