A carregar...
Publicação
Molecular characterization of alpha-thalassemia and the long-range regulation of alpha-globin gene expression
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 3.44 MB | Adobe PDF |
Autores
Resumo(s)
As hemoglobinopatias são doenças genéticas relacionadas com a hemoglobina (α2β2) que se classificam em qualitativas ou quantitativas. As primeiras são denominadas por variantes de hemoglobina e resultam de defeitos na estrutura da mesma, enquanto as últimas são conhecidas por talassémias, onde se inclui a α-talassémia. A α-talassémia é, geralmente, causada pela deleção de um ou mais genes α-globínicos, o que leva à redução de síntese de cadeias α-globínicas e do tetrâmero da hemoglobina. Daí advêm glóbulos vermelhos microcíticos e/ou hipocrómicos e, nalguns casos, anemia. Existem quatro condições clínicas reconhecidas para a α-talassémia, sendo que a gravidade do fenótipo varia consoante a razão de síntese entre as cadeias α- e β-globínicas. A ausência completa de cadeias de α-globina é fatal durante a gravidez ou logo após o nascimento e, como tal, corresponde à forma mais grave de α-talassémia. Por outro lado, as variantes de hemoglobina são geralmente causadas por mutações missense nos genes da α-globina e podem ser clinicamente benignas ou originar diversos graus de patogenicidade. Os genes α-globínicos encontram-se no agrupamento génico da α-globina, localizado no braço curto do cromossoma 16, sendo que a sua expressão é altamente e diferencialmente regulada durante os diferentes períodos do desenvolvimento embrionário, fetal e adulto. Esta regulação depende dos promotores dos genes α e de elementos localizados a montante dos mesmos, aos quais se dá o nome Multispecies Conserved Sequences (MCS-R1 a MCS-R4). O MCS-R2, também conhecido como HS40 ou α-MRE (Major Regulatory Element), localiza-se 40 kb a montante dos genes α-globínicos e é essencial para a regulação da expressão dos mesmos. A sequência deste enhancer apresenta variabilidade polimórfica, que é característica da ancestralidade de cada população, tendo sido descritos até ao momento seis haplótipos, denominados de A a F. Este estudo teve como objetivo contribuir para o conhecimento do espetro de deleções e mutações pontuais que causam α-talassémia ou levam ao aparecimento de variantes de hemoglobina de cadeia α, na população residente em Portugal, bem como estimar a relação existente entre os genótipos e os fenótipos observados em cada indivíduo. Para além disso, pretendeu-se identificar os diferentes haplótipos do HS-40 que estão associados à deleção de 3,7kb, a deleção α-talassémica mais comum, e determinar a sua ancestralidade na população Portuguesa. Assim, foram analisadas amostras de sangue de 17 indivíduos com suspeita de terem α-talassémia ou serem portadores de variantes de hemoglobina de cadeia α, previamente caracterizados a nível hematológico e bioquímico. O diagnóstico de α-talassémia foi realizado através de técnicas laboratoriais como Gap-PCR, Multiplex Gap-PCR Assay e Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). No que diz respeito ao diagnóstico das variantes, utilizou-se uma técnica de PCR convencional que permite amplificar os genes HBA2 e HBA1 separadamente, seguida de sequenciação de Sanger. Nas 11 amostras estudadas para α-talassémia através das técnicas Gap-PCR e Multiplex Gap-PCR foi possível diagnosticar quatro indivíduos heterozigóticos (genótipo -α 3,7/αα) e dois homozigóticos (genótipo -α 3,7/-α 3,7) para a deleção de 3,7kb, bem como um indivíduo com a deleção de 4,2kb em heterozigotia (genótipo -α 4,2/αα). Para os quatro indivíduos que não apresentam nenhuma das duas deleções anteriores, recorreu-se à técnica de MLPA para a pesquisa de deleções grandes e/ou desconhecidas. Esta metodologia permitiu identificar quatro deleções distintas em heterozigotia, a deleção do Sudeste Asiático (genótipo -SEA/αα) e três deleções que removem a região regulatório HS40: deleção (αα) ALT, deleção (αα) TI e deleção (αα) MM O diagnóstico molecular de variantes de hemoglobina de cadeia α foi realizado para nove amostras e permitiu identificar oito variantes missense raras. Após análise em bases de dados e realização de estudos in silico, foi possível concluir que cinco são benignas (Hb J-Paris, Hb Nouakchott, Hb Brugg, Hb Oleander e Hb Stanleyville-II), uma é provavelmente patogénica (Hb Westmead) e duas são patogénicas (Hb Legnano e Hb Setif). É ainda importante salientar que a Hb Stanleyville-II foi encontrada em dois indivíduos em associação com a deleção 3,7kb, e que a Hb Westmead foi encontrada em simultâneo com a deleção do Sudeste Asiático e com HbE (uma variante de cadeia β). Com o objetivo de identificar os haplótipos do HS-40 e determinar a ancestralidade da deleção 3,7kb, foi realizada uma técnica de PCR que permite amplificar um fragmento de DNA que contém a região
de interesse, seguida de sequenciação de Sanger. Nesta parte do estudo foram analisadas 111 amostras
de DNA: 61 de indivíduos diagnosticados com esta deleção [34 com o genótipo -α 3,7/αα (grupo II) e 27
com o genótipo -α 3,7/-α 3,7 (grupo III)], bem como 50 controlos sem α-talassémia (grupo I). As alterações genéticas detetadas nas sequências do HS-40 revelaram quatro haplótipos distintos denominados A, B, C e D. O haplótipo A foi encontrado em 60,4% dos alelos estudados, sendo o mais comum em todos os grupos, o que era expectável considerando que esta é a sequência ancestral. Em geral, o segundo haplótipo mais comum foi o B (29,7% dos alelos), tendo sido encontrado em 39,0% dos indivíduos sem α-talassémia e em 27,9% dos portadores da deleção de 3,7kb. No entanto, nos indivíduos com a deleção de 3,7kb em homozigotia, o haplótipo D foi o segundo mais observado, em 27,8% dos alelos. Por sua vez, o haplótipo C foi apenas encontrado em 1,3% dos alelos, todos eles em indivíduos controlo. No que diz respeito aos genótipos do HS-40, foram detetadas sete combinações diferentes designadas AA, AB, AD, BB, BC, BD e DD. As combinações AA e AB são as mais comuns em indivíduos sem αtalassémia (respetivamente 36,0% e 40,0%) e em indivíduos com o genótipo -α 3.7/αα (respetivamente 44,1% e 38,2%). No entanto, nos pacientes com o genótipo -α 3.7/-α 3.7 a combinação mais prevalente corresponde à AD (37,0%). Através de testes estatísticos verificou-se que a distribuição tanto de haplótipos do HS-40 como de genótipos apresenta diferenças significativas entre indivíduos com e sem α-talassémia. O haplótipo D, primariamente descrito na população Africana, foi neste trabalho identificado em frequências crescentes ao longo dos grupos estudados (I a III) com apenas 1,0% nos indivíduos sem αtalassémia, 4,4% nos portadores da deleção de 3,7kb e 27,8% nos pacientes com esta deleção em ambos os alelos. Na sua maioria este haplótipo foi encontrado na combinação AD, em indivíduos com a deleção de 3,7kb em homozigotia (grupo III), sendo que neste grupo, também foi possível encontrar o haplótipo D nas combinações BD e DD. Assim, é possível concluir que o haplótipo D está fortemente associado em cis a esta deleção α-talassémica, sugerindo uma origem Africana para esta deleção observada na população Portuguesa. Para validação desta conclusão foi realizada uma análise de correspondência múltipla que revelou que os indivíduos sem α-talassémia da população Portuguesa estão agrupados com outras populações europeias, enquanto que indivíduos com a deleção de 3,7kb se encontram separados destas e mais proximamente relacionadas com a população Africana. Pensa-se que a presença do haplótipo D possa resultar numa diminuição da expressão dos genes αglobínicos, uma vez que deriva do haplótipo A devido a uma substituição nucleotídica no local de ligação do fator transcricional NF-E2. Múltiplos estudos utilizando ratinhos revelaram que esta proteína atua como enhancer na expressão dos genes globínicos e, como tal, a sua ausência resulta em microcitose, anemia ligeira e numa diminuição da quantidade de hemoglobina. Após comparação dos parâmetros hematológicos de indivíduos com os genótipos AA, AD e DD deste último grupo, não foi possível verificar diferenças significativas entre os mesmos. Estes resultados podem dever-se ao tamanho reduzido da amostra, bem como ao facto de a regulação da expressão dos genes da α-globina em humanos diferir daquela observada em ratinhos. Assim, seria de extrema importância realizar este tipo de estudo numa amostra maior, bem como recorrer a testes da expressão do gene da luciferase sob o controlo de diferentes haplótipos humanos de HS-40. Em suma, este estudo permitiu identificar seis deleções distintas, três que removem um ou mais genes α-globínicos e três que afetam as regiões regulatórias que se encontram a montante do agrupamento génico da α-globina, bem como oito variantes raras de hemoglobina de cadeia α, das quais duas são consideradas patogénicas (Hb Legnano e Hb Setif) e uma é considerada como sendo provavelmente patogénica (Hb Westmead). Para além disso, foi possível diagnosticar um caso bastante complexo envolvendo a deleção α-talassémia do Sudeste Asiático, uma variante de cadeia α Hb Westmead e uma variante de cadeia β HbE que, segundo o nosso conhecimento, foi o primeiro caso em que estas hemoglobinopatias foram encontradas no mesmo indivíduo. Este estudo revelou ainda, pela primeira vez, uma associação entre um haplótipo específico do HS-40 com a deleção comum de 3,7kb na população Portuguesa, e a sua provável ancestralidade Africana.
Hemoglobinopathies are genetic diseases that comprise abnormal structural hemoglobin variants and thalassemias, where α-thalassemia is included. Alpha-thalassemia is typically caused by the deletion of one or more α-globin genes present in the α-globin gene cluster on the short arm of chromosome 16. These deletions lead to a reduction of α-globin chain synthesis, resulting in an excess of unpaired βchains. The α-MRE (Major Regulatory Element), also known as HS-40, is critical for α-globin gene expression regulation. The sequence of this enhancer presents polymorphic variability, where haplotypes may be identified, that is characteristic of each geographic population’s ancestry. The purpose of this research was to contribute to the knowledge of the spectrum of deletions and point mutations that cause α-thalassemia, or lead to α-chain hemoglobin variants in the population residing in Portugal. Furthermore, we intended to identify the different haplotypes of HS-40 associated with the 3.7kb deletion, the most common α-thalassemia deletion, and to determine the ancestry of this deletion in the Portuguese population. Through this study, we were able to identify six different deletions, three that remove one or more α-globin genes and three that affect the upstream regulatory elements, as well as eight rare α-chain hemoglobin variants, of which two are considered pathogenic (Hb Legnano and Hb Setif) and one that is considered likely pathogenic (Hb Westmead). Furthermore, it was possible to diagnose a very complex clinical case involving the Southeast Asian deletion, the α-chain hemoglobin variant Hb Westmead, and the β-chain hemoglobin variant HbE. As far as we know, this case is the first report of the co-inheritance of these three hemoglobinopathies in the same individual. This study also revealed, for the first time in the Portuguese population, an association between the specific HS-40 haplotype D and the common 3.7kb α-thalassemia deletion, and its likely African ancestry.
Hemoglobinopathies are genetic diseases that comprise abnormal structural hemoglobin variants and thalassemias, where α-thalassemia is included. Alpha-thalassemia is typically caused by the deletion of one or more α-globin genes present in the α-globin gene cluster on the short arm of chromosome 16. These deletions lead to a reduction of α-globin chain synthesis, resulting in an excess of unpaired βchains. The α-MRE (Major Regulatory Element), also known as HS-40, is critical for α-globin gene expression regulation. The sequence of this enhancer presents polymorphic variability, where haplotypes may be identified, that is characteristic of each geographic population’s ancestry. The purpose of this research was to contribute to the knowledge of the spectrum of deletions and point mutations that cause α-thalassemia, or lead to α-chain hemoglobin variants in the population residing in Portugal. Furthermore, we intended to identify the different haplotypes of HS-40 associated with the 3.7kb deletion, the most common α-thalassemia deletion, and to determine the ancestry of this deletion in the Portuguese population. Through this study, we were able to identify six different deletions, three that remove one or more α-globin genes and three that affect the upstream regulatory elements, as well as eight rare α-chain hemoglobin variants, of which two are considered pathogenic (Hb Legnano and Hb Setif) and one that is considered likely pathogenic (Hb Westmead). Furthermore, it was possible to diagnose a very complex clinical case involving the Southeast Asian deletion, the α-chain hemoglobin variant Hb Westmead, and the β-chain hemoglobin variant HbE. As far as we know, this case is the first report of the co-inheritance of these three hemoglobinopathies in the same individual. This study also revealed, for the first time in the Portuguese population, an association between the specific HS-40 haplotype D and the common 3.7kb α-thalassemia deletion, and its likely African ancestry.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Haplótipos do HS-40 Alfa-talassémia Genes da alfa-globina Variantes de hemoglobina Hemoglobinopatias Teses de mestrado - 2023