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Publicação
Antioxidant properties and enzymatic activity towards acetylcholinesterase in the macroalga Fucus vesiculosus and its variation with sex, growth stage and seasonality
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Ao longo dos anos, produtos baseados em plantas têm sido cada vez mais reconhecidos pelo seu valor intrínseco em vários setores benéficos na saúde humana, seja pelo contributo nutricional que fornecem, na medicina, como suplementos ou alternativas a produtos sintéticos. As algas são um grupo particularmente de interesse, cujas propriedades que as caracterizam já estão ligadas ao seu extenso uso tradicional em diversas regiões, como no Este Asiático (Japão, China, Tailândia, por exemplo). São organismos que residem em zonas costeiras, normalmente associados a um substrato rochoso, e que podem ser encontrados em inúmeras regiões ao longo do globo, sendo que são geralmente divididos de acordo com a pigmentação em três divisões: Rhodophyta (algas vermelhas), Phaeophyta (algas castanhas) e Chlorophyta (algas verdes). Em Portugal, Fucus vesiculosus, também conhecido como bodelha, é uma das espécies mais comuns encontradas na costa lisboeta. Classificada dentro da divisão Phaepohyta, a F. vesiculosus, possui um conjunto variado de características que a tornam bastante versátil na sua utilização, particularmente o seu teor baixo em gorduras, elevado conteúdo mineral e valor alto de polifenóis e polissacáridos não-digeríveis. Para além disto, F. vesiculosus contém florotaninos na sua estrutura, um subtipo de polifenóis derivados de floroglucinol característicos de algas castanhas e que estão normalmente associados a uma maior atividade antioxidante. Este tipo de propriedade é extremamente procurado devido aos seus benefícios na saúde humana – por norma, no processo de respiração aeróbica, são formadas espécies reativas de oxigénio (ROS) e espécies reativas de nitrogénio (RNS) onde as mais perigosas são o anião superóxido (O2-) e radical hidroxilo (OH). Estes radicais livres são mantidos em controlo pelo mecanismo de defesa de antioxidantes do organismo, de maneira a evitar os efeitos adversos que provêm da sobreprodução de ROS e RNS. Deste modo, um sistema debilitado de antioxidantes está associado a um aumento de ROS no organismo, o que conduz a stress oxidativo no organismo. Como consequência, este tipo de stress é relacionado com vários tipo de doenças crónicas e degenerativas, como: (i) cancro; (ii) doenças cardiovasculares, como aterosclerose, isquemia, hipertensão ou cardiomiopatia; (iii) doenças neurológicas, como Alzheimer, Parkinson, esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica; (iv) doenças pulmonares, como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica; (v) artrite reumatóide; (vi) doenças renais (glomerulonefrite e nefrite túbulo-intersticial); (vii) doenças oculares (cataratas) e (viii) pré-eclâmpsia em medicina pré-natal. Como brevemente descrito, uma das aplicações descritas de F. vesiculosus é no tratamento da doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer é um tipo de doença cerebral que danifica neurónios envolvidos em funções cognitivas. Os estados iniciais desta doença normalmente não são imediatamente detetados, sendo que os seus sintomas apenas começam a ser reconhecidos anos mais tarde, associados a sinais normais de envelhecimento. Sendo uma doença neurodegenerativa, a doença de Alzheimer progride ao longo dos anos, sendo que os sintomas iniciais podem impedir o normal funcionamento de certas atividades planeadas, evoluindo para a maneira de pensar, aprender, e, em estados mais avançados, afetar funções básicas do organismo, sendo que os pacientes nesta fase requerem cuidado por parte de terceiros. Os tratamentos atuais não impedem nem diminuem o dano dos neurónios, pelo que o tipo de medicina atualmente existente, procura atenuar os sintomas da doença. É nesta perspetiva que a utilização de F. vesiculosus se insere no contexto da doença de Alzheimer. No decorrer desta, por norma, existe perca de função colinérgica no sistema nervoso central, que contribui para a degradação de funções cognitivas associadas à doença de Alzheimer, o que resulta numa deficiência em acetilcolina (ACh), uma molécula que medeia neurotransmissão no cérebro. Assim, um tipo de tratamento sintomático associado à doença de Alzheimer consiste na inibição da enzima que cataliza a degradação da ACh – a acetilcolinesterase (AChE). Devido ao habitat onde se inserem (estuário do Tejo) as amostras de F. vesiculosus utilizadas neste estudo, o perfil de elementos presentes nesta alga é também de grande importância. Por um lado, fornece informações mais específicas relativamente aos minerais mais comuns e importantes nutricionalmente de F. vesiculosus (como Na, K, I, Ca, Fe, Mg, Cu, Zn e Mn). Por outro lado, permite o estudo do conteúdo de metais pesados que possam ter sido acumulados pelas amostras recolhidas no estuário do Tejo, não só permitindo a análise do potencial desta amostra na inclusão no mercado, como também o potencial desta alga como bioindicadora, bioremediadora ou bioacumuladora no habitat onde se insere. O objetivo desta dissertação passou por efetuar uma caracterização de F. vesiculosus colhida no estuário do Tejo. Tendo em conta a variação que esta alga pode sofrer na sua constituição, de acordo com o habitat onde cresce, condições ambientais e maturação, estudou-se a influência do estado de crescimento e sexo de F. vesiculosus em vários aspetos desta alga: conteúdo fenólico total (TPC); atividade antioxidante e a sua relação com TPC; compostos detetados por cromatografia líquida de alta eficiência com detetor de fotodíodos (HPLC-DAD) ao longo do crescimento e por sexo; inibição da acetilcolinesterase e composição mineral de F. vesiculosus. Para o efeito, foram definidos quatro grupos que indicam o estado de crescimento da alga, agrupados de acordo com o comprimento do talo (talo <20; 20-25 cm; 25-30 cm; >30 cm). Posteriormente, estes grupos foram subdivididos por sexo (macho ou fêmea) após observação de cada amostra à lupa e ao microscópio, obtendo quatro grupos diferentes de estado de crescimento por sexo (oito no total). Por último, as amostras foram extraídas a duas temperaturas de extração diferentes (25 ºC e 100 ºC), totalizando 16 grupos de amostras analisadas. Relativamente ao teor total de fenóis, os resultados sugerem que os machos no estado de crescimento mais jovem (talo <20 cm) possuem um teor fenólico mais elevado, partilhado nos dois tipos de extrações efetuadas. Isto poderá ser explicado pela presença de florotaninos de menor peso molecular nas fases mais jovens de crescimento, onde são mais comuns. Estes florotaninos de menor peso molecular são associados com uma atividade antioxidante maior, algo que também é corroborado pelos dados obtidos, que demonstram uma tendência similar entre maior atividade antioxidante e teor fenólico total nos machos mais jovens. No entanto, é importante referir que, por norma, os estados de crescimento mais altos (talo >30 cm) alcançaram valores altos em teor fenólicos, mas não mostraram a mesma tendência descrita para os estados mais jovens relativamente à atividade antioxidante. Na análise efetuada por RD- HPLC-DAD, os resultados sugerem que existe variação de componentes ao longo dos diversos estados de crescimento estudados, o que pode implicar a existência mais reforçada de certos compostos durante o desenvolvimento de F. vesiculosus e são, desta forma, encontrados em maior concentração. No entanto, futuramente, será necessária a identificação destes compostos através de cromatografia líquida – espetrometria de massa (LC-MS-MS) para melhor avaliar a variação detetada neste estudo.
Das amostras analisadas de F. vesiculosus, apenas três (20-25 cm machos, 25-30 cm machos e >30 cm fêmeas) mostrar alguma inibição da acetilcolinesterase. Estes resultados poderão ser explicados devido às amostras não terem sido purificadas previamente ao ensaio. Para além disto, a presença de fucoidanos e outros polissacáridos, que não possuem atividade inibitória poderão ter influenciado os resultados. Deste modo, no futuro, purificação das amostras utilizando extração em fase sólida (SPE) previamente ao ensaio pode originar extratos com maior atividade inibitória. Por último, a analise de elementos efetuada comprovou o potencial nutricional que F. vesiculosus fornece enquanto suplemento alimentar, especificamente pelo valor do iodo no tratamento do hipertiroidismo. Adicionalmente, os metais pesados detetados não ultrapassaram os limites superiores estabelecidos pelas organizações responsáveis pelas suas normas. No entanto, neste estudo, cádmio, um metal pesado anteriormente estudado em F.vesiculosus por ser facilmente bioacumulado por esta espécie, não foi estudado nesta dissertação, pelo que trabalhos futuros com amostras provenientes do estuário do Tejo deverão também incluir este elemento na sua caracterização. Em suma, esta dissertação provou vários dos benefícios providenciados por F. vesiculosus, para além de fornecer diretrizes no seu tempo ideal de colheita de acordo com o aspeto desejável que se procura, particularmente para o teor fenólico e atividade antioxidante, onde os estados mais jovens machos demonstraram ser de maior valor.
Fucus vesiculosus has been a subject of study due to being an extremely common coastal seaweed and to the benefic properties associated with it, either as a result of its high polyphenol content - in particular its phlorotannins, present only in brown algae – and the antioxidant activity associated with it. Additionally, new studies explore F. vesiculosus usage to inhibit acetylcholinesterase activity (AChE), an enzyme that catalyzes the breakdown of acetylcholine (ACh), associated with the treatment of symptons related to Alzheimer’s Disease. The high mineral content of F. vesiculosus is also of a great interest, both due to its nutritional importance in human health, and to detect the presence of heavy metals in the alga’s constitution, as it can clear its usage for human consumption and also study F. vesiculosus potential as a bioaccumulator and bioremediator. In this thesis, a characterization of F. vesiculosus provinient of Tagus estuary was carried out, particularly to study the influence of the growth stage and gender on different aspects of this seaweed properties: total phenolic content (TPC); antioxidant activity; compounds detected through high-performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD); inhibition towards acetylcholinesterase and mineral composition of F. vesiculosus. Four groups indicative of the growth stage of F. vesiculosus were defined according to the thallus length (thallus <20 cm; 20-25 cm; 25-30 cm; >30 cm) and the initial sample were divided amongst these. Thereafter, these four groups were divided by their gender (male or female) following microscopic observation, totaling eight groups. Finally, all samples were extracted at two different temperatures (100 ºC and 25 ºC), resulting in sixteen different groups of analyzed samples. Results suggest that the males belonging to the youngest growth stage (thallus <20 cm) demonstrate the higher phenolic content, across the two types of extract. Furthermore, the antioxidant activity assay shows a similar tendency. This may be due to phlorotannins remaining in shorter oligomeric forms when the thallus is younger, and such forms are associated with higher antioxidant activities, thus corroborating this data. F. vesiculosus compound analysis using HPLC-DAD suggests variations in components throughout its development, that may indicate that certain compounds are important in specifics parts of F. vesiculosus growth. On the other hand, out of the sixteen sets of samples, only three show some inhibition towards acetylcholinesterase (20-25 cm males, 25-30 cm males and >30 cm females) as the samples were not purified before this assay and thus the presence of fucoidans and other polysaccharides hinders the inhibitory activity. Lastly, elemental analysis further demonstrates the high nutritional value that F. vesiculosus minerals provide and shows no bioaccumulation of the heavy metals studied. As such, this thesis provides additional insight in the beneficial properties provided by F. vesiculosus, while providing a different approach in this alga’s characterization. By studying the influence of the growth stage and gender on the aspects described, it is possible to suggest an ideal harvesting time for F. vesiculosus from the Tagus estuary if one intends to fully optimize the alga’s phenolic content and antioxidant properties: the youngest male specimens (thallus length <20 cm).
Fucus vesiculosus has been a subject of study due to being an extremely common coastal seaweed and to the benefic properties associated with it, either as a result of its high polyphenol content - in particular its phlorotannins, present only in brown algae – and the antioxidant activity associated with it. Additionally, new studies explore F. vesiculosus usage to inhibit acetylcholinesterase activity (AChE), an enzyme that catalyzes the breakdown of acetylcholine (ACh), associated with the treatment of symptons related to Alzheimer’s Disease. The high mineral content of F. vesiculosus is also of a great interest, both due to its nutritional importance in human health, and to detect the presence of heavy metals in the alga’s constitution, as it can clear its usage for human consumption and also study F. vesiculosus potential as a bioaccumulator and bioremediator. In this thesis, a characterization of F. vesiculosus provinient of Tagus estuary was carried out, particularly to study the influence of the growth stage and gender on different aspects of this seaweed properties: total phenolic content (TPC); antioxidant activity; compounds detected through high-performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD); inhibition towards acetylcholinesterase and mineral composition of F. vesiculosus. Four groups indicative of the growth stage of F. vesiculosus were defined according to the thallus length (thallus <20 cm; 20-25 cm; 25-30 cm; >30 cm) and the initial sample were divided amongst these. Thereafter, these four groups were divided by their gender (male or female) following microscopic observation, totaling eight groups. Finally, all samples were extracted at two different temperatures (100 ºC and 25 ºC), resulting in sixteen different groups of analyzed samples. Results suggest that the males belonging to the youngest growth stage (thallus <20 cm) demonstrate the higher phenolic content, across the two types of extract. Furthermore, the antioxidant activity assay shows a similar tendency. This may be due to phlorotannins remaining in shorter oligomeric forms when the thallus is younger, and such forms are associated with higher antioxidant activities, thus corroborating this data. F. vesiculosus compound analysis using HPLC-DAD suggests variations in components throughout its development, that may indicate that certain compounds are important in specifics parts of F. vesiculosus growth. On the other hand, out of the sixteen sets of samples, only three show some inhibition towards acetylcholinesterase (20-25 cm males, 25-30 cm males and >30 cm females) as the samples were not purified before this assay and thus the presence of fucoidans and other polysaccharides hinders the inhibitory activity. Lastly, elemental analysis further demonstrates the high nutritional value that F. vesiculosus minerals provide and shows no bioaccumulation of the heavy metals studied. As such, this thesis provides additional insight in the beneficial properties provided by F. vesiculosus, while providing a different approach in this alga’s characterization. By studying the influence of the growth stage and gender on the aspects described, it is possible to suggest an ideal harvesting time for F. vesiculosus from the Tagus estuary if one intends to fully optimize the alga’s phenolic content and antioxidant properties: the youngest male specimens (thallus length <20 cm).
Descrição
Tese de mestrado em Biologia dos Recursos Vegetais, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
Palavras-chave
Fucus vesiculosus Florotanino Atividade antioxidante Acetilcolinesterase Metais pesados Teses de mestrado - 2020