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Publicação
Chaperone activity of neuronal S100 proteins
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Orientador(es)
Resumo(s)
Flutuações no metabolismo celular devido a inúmeras condições de stress, incluindo choque térmico, infeção ou inflamação, podem originar o enrolamento incorreto, a agregação e a disfunção de proteínas. Tais condições desencadeiam uma resposta fisiológica, caracterizada pela estimulação da expressão e consequente sobre-expressão de proteínas de choque térmico e chaperões moleculares. Em tais condições, estas moléculas auxiliam o processo de enrolamento de proteínas que se encontram incorretamente enroladas. Estes mecanismos de controlo de qualidade estão presentes em todas as células; contudo, em organismos superiores estas respostas desencadeiam processos de sinalização, e vários componentes atuam como moléculas sinalizadoras ou padrões moleculares associados a danos que ativam por exemplo a resposta imunitária, promovendo a reparação de tecidos e a resolução da inflamação. Os chaperões moleculares possuem várias propriedades que definem a sua atividade: reconhecem e ligam proteínas desnaturadas; e suprimem a agregação proteica, através da interação com as superfícies expostas nas proteínas desnaturadas. As proteínas S100 constituem uma família de pequenas proteínas ligantes de cálcio que interagem com um elevado número de proteínas. Esta família de proteínas possui três características únicas: (i) ligam cálcio através de dois motivos EF-hand em cada monómero, que diferem na sua sequência e nos modos de coordenação; (ii) são funcionais como dímeros ou oligómeros de maior ordem; (iii) são expressas de acordo com o tipo de célula e de tecido; e (iv) são exclusivas de vertebrados. Durante a inflamação e em resposta ao stress celular, a expressão destas proteínas aumenta consideravelmente, sugerindo que as proteínas S100 atuam em respostas celulares a situações de stress. Comunicações recentes sugerem que as S100 assistem e regulam interações ligando-complexo multichaperão. De facto, várias comunicações suportam a hipótese de que membros desta família possuem funções semelhantes a chaperões, tais como S100A1, S100A10, S100A12, S100A13 e S100B. Especificamente, neste projeto, nós estudamos a atividade como chaperões de quatro proteínas S100 (i.e., S100A6, S100B, S100A9 e S100A12), com elevada expressão no cérebro e associadas a neurodegeneração e neuroinflammação. Em primeiro lugar, foi realizado um estudo comparativo que visava verificar o efeito de temperaturas elevadas (50ºC) na conformação e estrutura secundária das proteínas em análise. Estas proteínas ocorrem em dois estados distintos de metalação: o estado apo (proteína livre de iões metálicos) e o estado holo (em que a proteína se encontra associada a um grupo prostético, neste caso cálcio). Estas propriedades levam-nos a realizar os ensaios tanto na ausência como na presença de iões cálcio. Os resultados obtidos demonstram que as proteínas S100 estudadas exibem estruturas hélice-α típicas em ambos os estados estudados. A elevação da temperatura não induziu alterações significativas na forma global dos espectros, indicando que estas proteínas conservam a sua estrutura secundária quando submetidas a altas temperaturas. No entanto, uma pequena diminuição na elipticidade dos espectros é observada, sugerindo uma perda não significativa do conteúdo em hélices-α. Estes resultados insinuam que a elevação da temperatura expôs resíduos hidrofóbicos anteriormente escondidos, o que resultou numa estrutura secundária menos compacta. Dado que o enrolamento global das proteínas S100 foi semelhante nas diferentes temperaturas estudadas, as alterações na estabilidade destas proteínas devido à ligação de cálcio foram avaliadas. Para isso, a desnaturação térmica das S100 foi monitorizada através do seguimento de alterações na elipticidade em função da temperatura, a um único comprimento de onda (222 nm). No geral, os resultados demonstram uma perda na elipticidade das proteínas em todas a condições estudadas, que corresponde à perda da estrutura secundária (hélices-α). Foram observadas transições bem definidas em todos os espectros. No entanto, a pós-transição não foi observada, sugerindo que estas proteínas possuem uma estabilidade térmica elevada, com uma temperatura de desnaturação térmica acima de 90 C. A ausência da pós-transição não permitiu a determinação do ponto médio da temperatura de desnaturação. Uma característica dos chaperões moleculares é o seu potencial para interagir com proteínas durante o seu processo de desenrolamento e para suprimir a agregação das suas proteínas substrato, em condições de stress. De modo a investigar as possíveis propriedades como chaperões moleculares das proteínas S100, o efeito das proteínas S100A6 e S100B na agregação da enzima citrato sintetase foi analisado in vitro. Como esperado para proteínas termoestáveis, as proteínas S100A6 e S100B, na ausência e na presença de iões de cálcio, não agregaram nas condições testadas, como se verificou pela ausência de alterações óticas relevantes na análise da dispersão de luz. Observou-se que estas proteínas são capazes de ligar estados não-nativos da citrato sintetase, suprimindo e adiando a agregação termicamente induzida (50 ºC) da citrato sintetase, quando adicionadas num excesso de 1.6 vezes, tanto na ausência como na presença de iões cálcio. Estes resultados sugerem que as proteínas diméricas S100A6 e S100B desempenham um papel protetor durante condições de stress térmico in vitro, exibindo propriedades anteriormente descritas para chaperões do tipo holdase, tanto no estado apo como no estado holo. Em todas as condições estudadas, a hidrolisação de ATP não foi necessária, implicando que a sua atividade como chaperão é independente de ATP. Comparando ambas as proteínas, a proteína S100B mostrou um melhor desempenho como holdase do que proteína S100A6, quando analisadas na ausência de iões cálcio. A presença de iões de cálcio, intensificou as propriedades protetoras da S100B, indicando que sua a função como holdase é superior no seu estado holo. A resistência e sobrevivência das células a temperaturas substancialmente fora da gama ótima do organismo resultam da ativação da resposta de choque térmico que, por sua vez, providência um mecanismo de defesa celular através da síntese intensa de proteínas de choque térmico e chaperões moleculares que impedem a acumulação de agregados proteicos e a consequente toxicidade proteica desta acumulação, restaurando a proteostase. A capacidade das proteínas S100 para prevenir agregação proteica em condições de stress in vivo foi estudada através sua transformação e sobre-expressão numa estirpe de Escherichia coli com deleção no gene dnaK (ΔdnaK). A expressão desta proteína de choque térmico (DnaK), é essencial para o crescimento da E. coli a temperaturas superiores a 42ºC, sendo por isso observável uma redução drástica no número de colónias formadas após a submissão da estirpe a condições de stress térmico de curta duração (50ºC, 45 minutos). Os resultados demonstraram que as células que sobre-expressavam S100A6 ou S100A12, conseguiam sobreviver quando expostas a altas temperaturas. No entanto, comparativamente com os controlos negativo (superóxido dismutase 1) e positivo (complexo DnaK-DnaJ-GrpE) realizados, a produção destas proteínas não teve efeitos significantes nas células. Por outro lado, a sobre-expressão da proteína recombinante S100B ou S100A9 em células de E. coli, aumentou a sua resistência ao stress térmico de curta duração. A razão de sobrevivência destas células é superior à obtida pelas células que produzem o controlo positivo. Estas observações sugeriram que as proteínas S100B e S100A9 interagem com certas proteínas da E. coli durante a exposição ao stress térmico, de modo a prevenir a sua agregação e reduzir a precipitação de proteínas parcialmente desnaturadas, que são toxicas para as células, restaurando a proteostase do organismo e providenciando evidencias in vivo da sua potencial atividade como chaperões. No geral, os resultados aqui apresentados, sugerem que as proteínas S100, além de serem moléculas pró-inflamatórias implicadas em diversas doenças neurodegenerativas e no envelhecimento, atuam como chaperões moleculares em situações de stress, estando deste modo envolvidas na manutenção da proteostase do cérebro, sugerindo um elo de ligação entre inflamação e a resposta ao stress celular. Estes dois conceitos estão cada vez mais a ser ligados a diversas doenças neurodegenerativas que são caracterizadas pela acumulação de proteínas desenroladas e pela deposição de agregados proteicos em neurónios. Desta forma, os resultados irão contribuir para o entendimento do papel das proteínas S100 nas vias sinalizadoras neuroinflamatórias durante o envelhecimento e doenças neurodegenerativas.
S100 are small dimeric calcium-binding proteins that regulate multiple intracellular and extracellular functions. These proteins are solely expressed in vertebrates, in a cell-type and tissue-specific manner. The observation that S100 proteins (i) are low molecular weight proteins; (ii) exist in different conformational states, including high molecular mass oligomers; (iii) have a secondary structure that is conserved at non-physiological temperatures; (iv) are highly resistant to thermal denaturation; (v) have expression levels that correlate with stress conditions; and (vi) interact with aggregation prone proteins led us to suggest that S100 proteins could act as molecular chaperones. Indeed, recent reports pointed out to the ability of S100 proteins to assist and regulate multichaperone complex-ligand interactions, suggesting chaperone-like activities of some family members, such as S100A1, S100A10, S100A12, S100A13 and S100B. In this project we studied four S100 proteins (i.e. S100A6, S100A9, S100A12 and S100B) that are highly expressed in the brain and have been associated with neurodegeneration and neuroinflammation. We started by analysing the conformational state of these proteins and its alterations due to a thermal shift to high temperatures (50ºC) and its stability. The results supported that S100 proteins, both in apo- and calcium-loaded states, exhibit typical α-helical structures, which is conserved at high temperatures, suggesting that these proteins are highly stable. Their stability was decreased in the presence of calcium ions. Additionally, we show here that recombinant human S100A6 and S100B proteins are able to protect a heat-labile enzyme (citrate synthase) from thermal aggregation. We also showed that expression of S100B or S100A9 in temperature-sensitive Escherichia coli with a deletion in the gene of the chaperone protein DnaK could rescue thermal stress insults. Altogether, these results support chaperone-like properties of S100 proteins in vitro and in vivo. In conclusion, apart from acting as pro-inflammatory molecules, S100 proteins may also be implicated in the maintenance of proteostasis (protein homeostasis) in the brain, an important biochemical process that is dysfunctional during aging and in neurodegenerative diseases. The chaperone-like properties of S100 proteins under stress conditions thus suggest a link between inflammation and cellular stress responses.
S100 are small dimeric calcium-binding proteins that regulate multiple intracellular and extracellular functions. These proteins are solely expressed in vertebrates, in a cell-type and tissue-specific manner. The observation that S100 proteins (i) are low molecular weight proteins; (ii) exist in different conformational states, including high molecular mass oligomers; (iii) have a secondary structure that is conserved at non-physiological temperatures; (iv) are highly resistant to thermal denaturation; (v) have expression levels that correlate with stress conditions; and (vi) interact with aggregation prone proteins led us to suggest that S100 proteins could act as molecular chaperones. Indeed, recent reports pointed out to the ability of S100 proteins to assist and regulate multichaperone complex-ligand interactions, suggesting chaperone-like activities of some family members, such as S100A1, S100A10, S100A12, S100A13 and S100B. In this project we studied four S100 proteins (i.e. S100A6, S100A9, S100A12 and S100B) that are highly expressed in the brain and have been associated with neurodegeneration and neuroinflammation. We started by analysing the conformational state of these proteins and its alterations due to a thermal shift to high temperatures (50ºC) and its stability. The results supported that S100 proteins, both in apo- and calcium-loaded states, exhibit typical α-helical structures, which is conserved at high temperatures, suggesting that these proteins are highly stable. Their stability was decreased in the presence of calcium ions. Additionally, we show here that recombinant human S100A6 and S100B proteins are able to protect a heat-labile enzyme (citrate synthase) from thermal aggregation. We also showed that expression of S100B or S100A9 in temperature-sensitive Escherichia coli with a deletion in the gene of the chaperone protein DnaK could rescue thermal stress insults. Altogether, these results support chaperone-like properties of S100 proteins in vitro and in vivo. In conclusion, apart from acting as pro-inflammatory molecules, S100 proteins may also be implicated in the maintenance of proteostasis (protein homeostasis) in the brain, an important biochemical process that is dysfunctional during aging and in neurodegenerative diseases. The chaperone-like properties of S100 proteins under stress conditions thus suggest a link between inflammation and cellular stress responses.
Descrição
Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
Palavras-chave
Chaperão molecular Proteínas S100 Agregação proteica Proteostasis Doenças neurodegenerativas Teses de mestrado - 2020