Impact of dietary supplements on reproductive function: Curcumin and Resveratrol

Abstract

A prevalência global da infertilidade feminina tem vindo a aumentar nas últimas décadas. Entre diversos fatores, a idade reprodutiva avançada das mulheres é uma das principais razões que contribuem para o aumento desta condição. Com o objetivo de amenizar estes efeitos tem sido proposta a introdução na alimentação de suplementos com propriedades antioxidantes de forma a promover o aumento da fertilidade. Neste contexto é cada vez maior a procura de substâncias naturais em detrimento de compostos sintéticos. Atualmente, a curcumina (CUR) e o resveratrol (RES), na sua forma pura ou em conjugação com outras substâncias naturais, são dos suplementos alimentares mais procurados. A curcumina e o resveratrol são dois polifenóis com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias já demonstradas em diferentes tipos de células. A curcumina (1,7-bis-(4-hydroxy3-methoxyphenyl) -1,6-hepadiene-3,5-dione), é o principal ingrediente ativo isolado das raízes da planta Curcuma Longa também conhecida por açafrão-da-terra, açafrão-da-Índia ou gengibre amarelo. A CUR, pigmento responsável pela tonalidade alaranjada característica da curcuma, além de apresentar propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, provoca a morte celular por apoptose em células tumorais. Adicionalmente, a CUR tem sido correlacionada com a prevenção de doenças como a doença de Alzheimer, depressão, doenças cardiovasculares, artrite e outras doenças crónicas relacionadas com o envelhecimento. Por outro lado, estudos in vitro utilizando CUR, sugerem uma diminuição na viabilidade das células cancerígenas, assim como uma diminuição da angiogénese. Para comprovar estes efeitos será necessário aumentar a investigação nesta área de modo a confirmar a relação entre a toma deste suplemento e um melhoramento na prevenção/combate do cancro. O resveratrol (3,5,4’-trihydroxystilbene) é sintetizado por diversas plantas em resposta aos raios UV, toxinas, fungos ou agentes patogénicos. Este composto, encontrado principalmente em vinho tinto, cacau, amendoim ou mirtilos, apresenta atividades biológicas e farmacológicas que se revelaram eficazes na proteção cardiovascular e cerebral. Contudo, uma das maiores dificuldades no uso da CUR e do RES está relacionada com a biodisponibilidade que apresentam. Estudos indicam, que os valores detetáveis no plasma após o consumo de CUR ou RES são bastante reduzidos, sendo a sua eliminação rápida e a absorção residual. Este trabalho surge com o objetivo de entender o efeito destes dois compostos no ciclo ovárico, sendo realizado com recurso a células da granulosa. As células da granulosa rodeiam o ovócito e mantém uma relação direta com o mesmo através de troca de nutrientes e produção de hormonas necessárias à sua manutenção e desenvolvimento. Entre outros fatores, defeitos nestas células podem contribuir para casos de infertilidade feminina sendo pertinente o estudo da CUR e do RES nas suas principais funções. Os principais objetivos deste projeto prendem-se com i) o estudo do impacto direto de diferentes concentrações de CUR e RES na viabilidade das células da granulosa ii) a avaliação de ambos os compostos ao nível da proteção contra o stress oxidativo iii) com possíveis alterações ao nível da função hormonal destas células. Deste modo, foi utilizada a linha celular COV434 com as quais se procedeu à análise do efeito de diferentes concentrações de CUR e RES. Apesar da vasta utilização de linhas celulares em diversas áreas de investigação, devido ao seu papel de relevo no complemento de estudos in vivo e no estudo de processos celulares, estas podem diferir fenotípica e geneticamente do tecido de origem. Em contrapartida, culturas de células primárias retêm diversas características e funções observadas in vivo, sendo um valioso modelo na transição para a área clínica. Após ensaios com ambos os compostos na linha celular, procedeu-se a igual avaliação utilizando culturas primárias de células da granulosa de pacientes submetidas a tratamentos de reprodução medicamente assistida (TRA). Durante a colheita dos ovócitos, o líquido folicular foi recolhido e os ovócitos isolados para posterior fertilização in vitro ou injeção citoplasmática (ICSI). Após o consentimento informado das pacientes, o restante líquido folicular foi transportado para laboratório onde se procedeu ao isolamento e purificação das células da granulosa. De acordo com os nossos resultados, os ensaios de viabilidade demonstram que a CUR exerce um efeito duplo. Através da realização de ensaios de MTT e LDH, verificamos que em baixas concentrações, a CUR provoca um ligeiro aumento na viabilidade das células da granulosa, enquanto que em concentrações elevadas provoca necrose, a viabilidade diminui e a libertação de LDH aumenta em ambos os modelos celulares. Contudo, nas concentrações de 1 e 5 μM de CUR, ocorre uma diminuição na viabilidade celular sem libertação de LDH, sugerindo apoptose. Este facto foi explorado através da análise da morfologia, utilizando microscopia de contraste de fase, colorações de Giemsa e Höechst e análise do potencial da membrana mitocondrial. Em seguida, foi avaliada a atividade da PARP-1 e das caspases -3/7 e caspase -9. Os resultados sugerem apoptose nas células primárias da granulosa, contudo mais estudos são necessários. As espécies reativas de oxigénio (ROS) foram de igual modo analisadas, pois o aumento da sua produção está associado a um incremento no stress oxidativo das células, que se pode refletir na qualidade dos ovócitos. Após tratamento das células da granulosa com baixas concentrações de CUR e posterior indução de stress com recurso ao hidroperóxido de terc-butila (TBHP), a produção de ROS foi verificada. Identificamos uma diminuição nos níveis de ROS nas células previamente incubadas com CUR quando comparados com os níveis de ROS das células tratadas isoladamente com o indutor de stress. Estes resultados enaltecem as propriedades antioxidantes deste composto. Contudo, apesar de não se verificarem alterações na viabilidade celular após adição de baixas concentrações de CUR, procedemos ao estudo da função hormonal das GC de modo a garantir que esta não se encontra afetada. Foram identificadas diferenças na produção de estradiol e progesterona e na expressão dos genes associados, StAR, CYP11A1, 3β-HSD e aromatase (CYP19A1), que desempenham um papel chave na síntese das hormonas. Com baixas concentrações não são detetadas diferenças ao nível da expressão dos genes estudados, contudo a concentrações supra fisiológicas, a utilização de CUR sugere uma interferência na síntese de estradiol. No entanto, os resultados da adição de diferentes concentrações de RES na linha celular não são concordantes com os obtidos nas células primárias da granulosa, sugerindo que estas últimas são menos sensíveis ao composto fenólico. Além disso, a análise da produção de ROS, o estudo do potencial da membrana mitocondrial e os estudos morfológicos realizados, não sugerem ocorrência de apoptose nas células da granulosa. O potencial antioxidante do RES foi igualmente avaliado e, tal como na CUR, não verificamos alterações dos níveis basais de ROS. No entanto, sugere algum tipo de proteção das células da granulosa após indução de stress. Por fim, no que diz respeito à função hormonal das células, os nossos resultados indicam que não existem alterações nos níveis de estradiol e progesterona a baixas concentrações, o que não se verifica a altas doses de RES, que revelam um aumento do estradiol. Por conseguinte, estes resultados sugerem que o RES altera a função hormonal das células da granulosa. Em síntese, este estudo sugere que o consumo moderado de suplementos de RES e/ou CUR, promove melhoria na qualidade dos ovócitos. No entanto, quando em conjunto com coadjuvantes, como é o caso da piperina, a biodisponibilidade de ambos os compostos aumenta. O aumento da biodisponibilidade pode traduzir-se em consequências negativas para as células da granulosa, uma que vez que concentrações elevadas de CUR e RES levam à diminuição da viabilidade celular e comprometem a função hormonal.

Global infertility prevalence has been increasing in recent decades. Among various factors, advanced reproductive age of women is a major contributor to the widening of this condition. Concerned women look for dietary supplements with antioxidant properties advertised as a natural way to increase fertility. Curcumin (CUR) and resveratrol (RES) are two highly acclaimed polyphenols with antioxidant and anti-inflammatory properties widely described in different cell types. Curcumin, isolated from the roots of the Curcuma Longa plant, is a yellow pigment commonly used in Asian countries, especially in India. In addition to its antioxidant and anti-inflammatory properties, CUR elicits apoptotic cell death as evidenced in some tumor cells. Resveratrol, in turn, is produced by plants in response to UV rays, toxins, fungal attacks or pathogens. It is mainly present in red wine, cocoa, peanuts or blueberries. In recent years, it has been extensively studied and its importance increased due to its biological and pharmacological activities that have proved to be effective in cardiovascular and brain protection. In this work, the effect of both compounds on granulosa cells (GC) was studied. GC surround the oocyte and maintain a direct contact with it through the nutrient exchange and hormone production necessary for its development. Their normal function is crucial, since defects in these cells can contribute to women infertility. For this purpose, COV434 cell line and primary human granulosa cells (hGC) cultures from patients undergoing assisted reproductive technology (ART) were used. During the experiments, GC were treated with different concentrations of CUR and RES (0.001-50μM) at different times (24-72h). Low concentrations of both compounds showed an increase on cell viability and did not exert visible changes on cell morphology. Likewise, they lead to a decrease in ROS formation after stress induction, suggesting a protective role of CUR and RES. Changes in hormonal levels were not observed at these doses. In contrast, high concentrations of both compounds triggered a reduction on cell viability, accompanied by LDH release, suggesting cytotoxic effects. Allied to the above results, high doses of CUR and RES affected hormonal function of GC. CUR has a more evident dose-response effect; however, at 1-5 μM a reduction on cell viability without LDH release was observed, suggesting a programmed cell death mechanism. This work reinforces the importance of dietary supplements, namely CUR and RES, on the functions of GC and, consequently, on reproductive success.