Dissecting the cellular and molecular mechanisms of IL-7-mediated leukemia T-cell survival proliferation and cell growth

Abstract

T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) constitutes an aggressive subset of ALL, the most frequent childhood malignancy. Although risk-adjusted chemotherapeutic regimens are currently extremely effective, they frequently associate with significant long-term side effects. Moreover, cases that do not respond to therapy or that relapse have dismal prognosis. Thus, better therapies focused on efficacy and specificity against T-ALL cells are necessary. Understanding the biology and molecular pathogenesis of T-cell leukemogenesis is critical to carry out this goal. Interleukin-7 (IL-7) and its receptor (IL-7R; heterodimer constituted by IL-7Rα/IL7R and γc/IL2RG subunits) are essential for normal T-cell development and there is considerable evidence that IL 7-mediated signaling may promote leukemogenesis. Mice overexpressing IL-7 develop B- and T-cell lymphomas and increased expression of IL-7Rα, present in AKR/J mice, promotes development of T-cell tumors. Furthermore, IL-7 promotes T-ALL expansion in vivo and leukemia cell survival and proliferation in vitro. We assessed whether activating IL-7R mutations could occur in T-ALL. We found that 9% of T-ALL patients harbor somatic gain-of function IL7R mutations. The majority introduced an unpaired cysteine in exon 6 and promoted IL-7Rα homodimerization, which led to constitutive signaling that relied exclusively on Jak1. We found that IL7R mutations promote cell transformation and tumor formation. Importantly, mutant IL-7R signaling (and consequent increase in viability and proliferation) was targetable with Jak/STAT5 pathway inhibitors (Chapter 2). Previously, we have shown that IL-7 promotes leukemia cell survival and proliferation in vitro by activating PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The observation that IL-7-driven murine lymphomagenesis requires STAT5 and the fact that IL-7R-mutated T-ALL are sensitive to Jak/STAT5 pathway inhibitors, led us to investigate the role of this pathway in T-ALL. Here, we showed that inhibition of STAT5 in T-ALL completely abrogates IL-7-mediated T-ALL cell viability, growth and proliferation. Importantly, we demonstrated that survival mediated by IL-7 via STAT5 was independent from expression of Bcl-2 family members. Next generation sequencing analysis (NGS) revealed that PIM1 kinase is a direct STAT5 target in the context of IL-7 signaling and that PIM1 is required for IL-7/Jak/STAT5-mediated functional effects. In addition, we provide evidence that IL-7 downregulates the expression of BCL6 and promotes transcription of an alternate transcript (Chapter 3). Autophagy may mitigate stress, such as that induced by oncogene-driven proliferation or chemotherapy, in cancer cells. However, when persistent, its protective role may shift to what is called autophagic cell death. Since IL-7 promotes activation of mTOR, a master negative regulator of autophagy, we decided to explore whether IL-7 may also regulate T-ALL cell autophagy. We demonstrated that IL-7 modulates autophagy in T-ALL cells in a complex manner that involves triggering both pro- (MEK/Erk) and anti- (PI3K/Akt/mTOR) autophagic signaling pathways. Our data suggest that depending on the microenvironmental cues, IL-7 uses a 'flexible strategy' to shift the signaling pathway required for survival. In a nutrient-rich microenvironment (low autophagy) IL-7 inhibits autophagy and survival relies on PI3K/Akt/mTOR, while in nutrient-poor conditions (high autophagy) IL-7 promotes autophagy and survival relies on MEK/Erk pathway activation (Chapter 4). IL-7 maintains cell size and metabolic activity in normal T-cells. Also, IL-7 promotes expression of Glut1 and hexokinase II (HK2), both involved in glycolysis. In T-ALL, we previously showed that IL-7 mediated cell growth, promoted glucose use and Glut1 expression. Using NGS data obtained in Chapter 2, we extended the knowledge on IL-7-mediated T ALL cell metabolism. We provide significant evidence that IL-7 is broadly involved in upregulation of glycolysis in T-ALL. Gene expression analysis showed that IL-7 promotes very early expression of several glycolytic genes, including those involved in key stages of glycolysis regulation (Chapter 5). Taken together, the studies presented in this work significantly expand our understanding of the role of the IL 7/IL-7R signaling axis in T-ALL. The discovery of oncogenic IL7R mutations may have important therapeutic implications in T-ALL. In addition, we provide clear evidence that targeting Jak/STAT5/PIM1 and MEK/Erk pathways in IL-7 signaling constitute new promising therapeutic targets. We also unravel new roles for IL-7 in important physiological processes, such as autophagy and glycolysis, which may help devise new therapeutic strategies in T-cell leukemia.

A leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) constitui um subtipo agressivo de LLA, o cancro pediátrico mais comum. Apesar do grande sucesso obtido com regimes quimio-terapêuticos ajustados ao risco, a sua eficácia está frequentemente associada a efeitos secundários substanciais e os casos que não respondem a terapia ou que recidivam têm muito mau prognóstico. Portanto, são necessárias melhores terapias focadas na eficiência e especificidade contra as células leucémicas. Compreender a biologia e patogénese molecular que contribuem para o desenvolvimento de LLA-T é fundamental para atingir este objectivo. A interleucina-7 (IL-7) e o seu receptor (IL-7R; heterodímero constituído pelas subunidades IL-7Rα/IL7R e γc/IL2RG) são essenciais para o desenvolvimento de células T normais, existindo igualmente evidência de que a sinalização mediada por IL-7 promove leucemia. Ratinhos que sobre-expressam IL-7 desenvolvem linfomas de células B e T, e a expressão aumentada de IL-7Rα, presente em ratinhos AKR/J, promove o desenvolvimento de tumores de células T. Adicionalmente, a IL-7 promove a expansão de LLA-T in vivo e sobrevivência e proliferação celular in vitro. Nós estudámos a existência de mutações activadoras do IL-7R em LLA-T e descobrimos que 9% dos pacientes ao diagnóstico são portadores de mutações somáticas activadoras de IL7R. A maioria das mutações introduz uma cisteína não-emparelhada no exão 6 que promove homodimerização de cadeias IL-7Rα, resultando em sinalização constitutiva exclusivamente dependente de Jak1. Também revelámos que as mutações em IL7R promovem transformação celular e formação de tumores. É importante salientar que a sinalização do IL-7R mutante, e consequente aumento da viabilidade e proliferação celulares, são significativamente limitadas por inibidores da via Jak/STAT5 (Capítulo 2). No passado, demonstrámos que a IL-7 promove sobrevivência e proliferação de células leucémicas pela activação da via de sinalização PI3K/Akt/mTOR. No entanto, a observação de que a formação de linfomas murinos mediada por IL-7 requer STAT5 e o facto de células LLA-T com mutação no IL-7R serem sensíveis a inibidores da via Jak/STAT5, levou-nos a investigar o papel desta última via em LLA-T. Neste trabalho nós demonstrámos que STAT5 é essencial para o papel da IL-7 na viabilidade, crescimento e proliferação de células de LLA-T. Contudo, verificámos também que o efeito da IL-7 via STAT5 na sobrevivência das células leucémicas é independente da expressão de Bcl-2. Para tentar identificar o mecanismo envolvido, efectuámos análise de sequenciação de nova geração (NGS) que revelou que a cinase PIM1 é um alvo directo de STAT5 no contexto de IL-7 e é necessário para os efeitos funcionais do eixo de sinalização IL-7-Jak/STAT5. Adicionalmente, os nossos estudos sugerem que a IL-7 diminui a expressão de BCL6 e promove a transcrição de um transcrito alternativo (Capítulo 3). A autofagia pode mitigar o stresse em células cancerígenas resultante, por exemplo, de proliferação mediada por oncogenes ou de quimioterapia. No entanto, quando persistente, o seu papel protector pode alterar-se para o que é designado de morte mediada por autofagia. Dado que a IL-7 promove activação de mTOR, o principal regulador negativo da autofagia, decidimos estudar se a IL-7 poderia regular autofagia em LLA-T. Os nossos estudos demonstram que a IL-7 regula autofagia em LLA-T de uma forma complexa, que envolve a activação de vias pro- (MEK/Erk) e anti- (PI3K/Akt/mTOR) autofágicas. Dependendo do contexto microambiental, a IL-7 usa uma ‘estratégia flexível’ para alterar a via de sinalização requerida para a sobrevivência. Num microambiente rico em nutrientes (baixa autofagia) a IL-7 inibe autofagia e a sobrevivência celular depende da activação da via PI3K/Akt/mTOR. No entanto, num microambiente pobre em nutrientes a IL-7 passa a aumentar a autofagia e a sobrevivência depende da via MEK/Erk (Capítulo 4). A IL-7 mantém o tamanho celular e activação metabólica em células T normais. A IL-7 também promove a expressão de Glut1 e hexocinase II (HK2), ambos envolvidos em glicólise. Em LLA-T, demonstrámos previamente que a IL-7 regula o crescimento celular, uso de glucose e expressão de Glut1. Usando dados de NGS obtidos no Capítulo 2, nós aprofundámos o conhecimento relativo à regulação do metabolismo celular em LLA-T mediado por IL-7. Os nossos resultados sugerem que a IL-7 tem um impacto bastante mais generalizado na regulação de glicólise em células de LLA-T do que antecipado. A análise da expressão génica mostrou que a IL-7 promove a expressão precoce de vários genes da glicólise, incluindo os envolvidos em pontos-chave de regulação glicolítica (Capítulo 5). Tomados em conjunto, os estudos apresentados nesta tese expandem consideravelmente o nosso conhecimento do papel do eixo de sinalização IL-7/IL-7R em LLA-T. A descoberta de mutações oncogénicas no IL-7R poderá ter importantes implicações terapêuticas em LLA-T. Adicionalmente, nós fornecemos evidências claras de que as vias Jak/STAT5/PIM1 e MEK/Erk poderão constituir novos alvos terapêuticos. Finalmente, desvendámos papéis que a IL-7 tem em importantes processos fisiológicos como autofagia e glicólise, o que não apenas aumenta o entendimento corrente da biologia da IL-7 e da leucemia T mas poderá também contribuir para a criação de novas estratégias terapêuticas em LLA-T.