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Studying laminins in skeletal muscle development: regulators of muscle stem cells and synaptic organizers
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Resumo(s)
O desenvolvimento do músculo, ou miogénese, é um processo bastante conservado entre os vertebrados. Todos os músculos-esqueléticos do tronco e dos membros são provenientes dos sómitos, estruturas epiteliais que se formam em ambos os lados do tubo neural. Os sómitos são posteriormente padronizados em diferentes compartimentos que darão origem a diferentes linhagens celulares. A porção mais ventral do sómito perde a sua estrutura epitelial e forma o esclerótomo, fonte de células precursoras do esqueleto axial. A porção mais dorsal, o dermamiótomo, permanece epitelial e é constituído pelos precursores miogénicos (MPCs) e os percursores da derme, entre outros.
Os músculos-esqueléticos iniciam o seu desenvolvimento quando os progenitores no dermamiótomo, que expressam os factores de transcrição Pax3 e/ou Pax7 são induzidos a activar o programa de diferenciação miogénica, controlado pelos factores regulatórios da miogénese (MRF), nomeadamente Myf5, MyoD, Mrf4 e Miogenina.
O dermomiótomo encontra-se dividido em três compartimentos distintos: (1) dermomiótomo dorsomediano (2) dermomiótomo central e (3) dermomiótomo ventrolateral. O desenvolvimento dos músculos epaxiais inicia-se no ratinho por volta de E8.5 com a formação do miótomo através da adição das células do dermamiótomo quando estas delaminam do dermomiótomo e povoam a zona ventral ao dermamiótomo para constituir o miótomo. As células precursoras musculares no dermamiótomo, ou células musculares estaminais, que passam a expressar os MRFs, entram no miótomo como mioblastos, mas no miótomo acabam por diferenciar-se em miócitos. O miótomo cresce nos estádios subsequentes com a adição progressiva de células estaminais musculares que diferenciam. Com o início da dissociação do dermamiótomo a E10.5, os progenitores que não se diferenciam acabam por migrar para as massas constituídas por miócitos. Entre E11.5 e E14.5, alguns destes progenitores diferenciam-se em mioblastos primários que fundem com os miócitos para formar as fibras primárias- miogénese primária. Durante os estádios subsequentes até ao nascimento, outra porção de células estaminais que se diferencia em mioblastos, desta vez secundários, que se fundem entre si para formas as fibras secundárias, mas também fundem com as fibras primárias. Esta fase é responsável pelo aumento do tamanho das massas musculares, quer em número de fibras quer no tamanho das mesmas. O sistema de inervação do músculo, mais especificamente a formação das junções neuromusculares (NMJs), sinapses especializadas que se formam entre o músculo e o nervo, desenvolve-se em paralelo com a miogénese. O primeiro contacto entre músculo e nervo antecede o início da miogénese secundária. Por esta altura, já existe uma pré-padronização da distribuição dos receptores de acetilcolina (AChR) no músculo, que será posteriormente remodelada. Dado que a miogénese e a inervação são processos interdependentes para o correcto funcionamento do músculo, estes processos requerem uma comunicação estruturada entre o músculo e o nervo.
Durante a miogénese secundária (por volta de E16.5) as células musculares estaminais, positivas para Pax7, migram para o espaço existente entre a fibra muscular e a membrana basal. Esta localização é mantida pelas células estaminais musculares que não se diferenciam durante a miogénese in utero e que constituem a população de células satélite, as células estaminais musculares adultas. Dado que estas se encontram em contacto directo com a membrana basal, a matriz extracelular adquire um papel crucial na regulação do comportamento destas células. Os diferentes elementos que constituem a membrana basal, tais como colagénio, perlecano e laminina permitem que as células estaminais musculares reconheçam o microambiente que as envolve. Além do microambiente que providencia à fibra e às células estaminais musculares durante o desenvolvimento do músculo esquelético, a membrana basal é um componente essencial no desenvolvimento das NMJs.
De entre os vários componentes da membrana basal, as lamininas são dos componentes mais bem estudados. As lamininas são trímeros, que apresentam uma estrutura cruciforme ou em T com três cadeias: alpha (α), beta (β) e gamma (γ). Actualmente são conhecidas 16 isoformas diferentes denominadas com base na sua constituição. Por exemplo, a laminina 211 é constituída pelas cadeias α2, β1 e γ1. As lamininas ligam-se principalmente a dois tipos de receptores no músculo: (1) integrinas, receptores transmembranar compostos por duas sub-unidades alpha (α) e beta (β); (2) distroglicano, que se liga intracelularmente à distrofina. Durante a miogénese secundária, as principais isoformas presentes no músculo e nas NMJ são, respectivamente, 211, 411, 511 e 221, 421 e 521. Porém, no músculo adulto, a isoforma que permanece a volta das miofibras é a 211, enquanto nas NMJs adultas continuam presentes as isoformas 221, 421, 521, todas elas cruciais para o desenvolvimento e correcto funcionamento do sistema neuromuscular. As lamininas são determinantes desde cedo no desenvolvimento do músculo-esquelético durante a formação do miótomo através do controlo do balanço entre proliferação e diferenciação das células do dermamiótomo. Em estádios mais tardios do desenvolvimento fetal, as lamininas são parte integrante do microambiente das fibras e das células estaminais musculares que parece ser determinante para o crescimento normal das massas musculares. Em paralelo, as lamininas desempenham papel igualmente preponderante durante o desenvolvimento das junções neuromusculares
As células estaminais musculares localizadas entre a membrana basal e a fibra representam no músculo adulto a principal fonte da capacidade regenerativa. Para que a reserva de células estaminais musculares não se esgote é necessário garantir que exista um equilíbrio entre a proporção de células que se mantêm quiescentes, as células que são activadas e as células que se diferenciam no momento da regeneração. A membrana basal que hospeda estas células representa um elemento determinante em distintas vias de sinalização que operam no sentido de instruir as células a manterem-se quiescentes, a activar, a proliferar ou diferenciar. A sinalização Notch destaca-se como reguladora deste processo. Quando abolida, as células estaminais musculares diferenciam-se precocemente sem a necessária proliferação que permite manter a população e desta forma a população acaba por esgotar-se. A Distrofia muscular congénita merosina negativa (MDC1A) é um tipo de distrofia causado por mutações no gene LAMA2 que levam à perda das lamininas 211 e 221 da membrana basal das fibras e junções neuromusculares, respectivamente. Esta doença é caracterizada por fraqueza muscular, neuropatia, dificuldades respiratórias, entre outros sintomas. Neste estudo, usámos o modelo de ratinho dyW como modelo de estudo para a MDC1A. Estudos recentes do nosso laboratório demonstraram que no ratinho, o desenvolvimento da MDC1A inicia-se in utero entre E17.5 e E18.5. O início desta distrofia é demarcado por uma diminuição significativa no número de células positivas para Pax7, em paralelo com uma diminuição do crescimento do músculo fetal.
O trabalho realizado nesta tese teve como objectivo compreender melhor como é que as células musculares constroiém o seu microambiente e de que forma alterações no microambiente tanto das células musculares como das junções neuromusculares influencia o crescimento do músculo fetal.
Numa primeira abordagem, avaliámos a capacidade das células musculares, tanto as células estaminais musculares como as fibras, de produzirem e montarem as matrizes de laminina. Os nossos resultados demonstram que numa fase inicial da miogénese secundária, as células estaminais musculares são as principais produtoras de laminina no músculo e montam as suas matrizes de laminina mesmo na ausência das fibras. Durante fases mais tardias da miogénese secundária, as fibras passam a expressar os diferentes genes de laminina e a sua presença parece ser importante para que as matrizes de laminina sejam mantidas no microambiente das células estaminais musculares. Desta forma, este trabalho revela que as células musculares desempenham papéis diferentes na construção das matrizes de laminina em fases distintas da miogénese secundária e que as células estaminais e as fibras são interdependentes na construção das matrizes de laminina.
Numa segunda abordagem, esta tese teve como objectivo compreender em maior detalhe o papel da laminina 221 durante a formação das NMJs e compreeender a sua influência no início/progressão da MDC1A. Para tal, estudámos o desenvolvimento das NMJs durante a miogénese secundária em ratinhos dyW. Os nossos resultados revelam que enquanto as lamininas α2 e α4 não aparentam ter um contacto directo com sinapse a E15.5, as lamininas α5 apresentam uma proximidade com a sinapse. Esta dinâmica não parece estar alterada na ausência da laminina α2 (211/221). Contudo, a nossa análise do desenvolvimento das NMJ na ausência de laminina 221, ainda que preliminar, sugere que a distribuição dos receptores de acetilcolina está alterada e que há uma tendência para que os receptores se encontrem mais dispersos ao longo do músculo na ausência de lamininas α2. Estes resultados apontam para um papel das lamininas na agregação dos receptores junto da fenda sináptica.
Em suma, o trabalho desenvolvido ao longo desta tese realça a complexidade das dinâmicas de produção e construção das matrizes de laminina durante a miogénese secundária. Os dados desta tese exemplificam igualmente a diversidade de microambientes aos quais as células estaminais estão sujeitas durante diferentes fases da miogénse secundária. Esta tese analisa em particular o papel das lamininas α2 durante o desenvolvimento das NMJs e fornece novas evidências acerca da influência da inervação do músculo no início da MDC1A.
MDC1A is a crippling neuromuscular disease caused by the absence of the α2-chain of laminins 211/221, major components of basement membranes. The onset of this disease during development in utero is marked by impaired muscle growth which correlates with a reduction in the number of mononucleated muscle cells in the fetal muscle masses (Nunes et al., 2017). Skeletal muscle development starts during early embryogenesis, when the dermomyotomal Pax3- and/or Pax7-positive muscle precursors cells are induced to enter the myogenic program and subsequently delaminate from the dermomyotome to form the myotome. Later on, when the dermomyotome dissociates, Pax3- and/or Pax7-positive muscle stem cells are released, some of which differentiate into myoblasts and fuse with myotomal cells or with each other, forming the primary myofibers during primary myogenesis that occurs between E11.5 and E14.5. The primary myofibers later serve as a scaffold for the formation of secondary myofibers and secondary myoblasts fuse with both primary and secondary myofibers to increase their size. Motor axons enter the muscle masses in parallel with primary myogenesis, but it is during secondary myogenesis (between E14.5 until birth) that the nerve contacts the muscle, and proper innervation is essential for normal fetal muscle development. During mid-secondary myogenesis, the Pax7-positive muscle stem cells become closely associated with the myofibers and their basement membrane. Laminin 211 and 221 are assembled around the adult myofiber and synaptic endplate, respectively, and are known to play important roles both in myofiber and neuromuscular junction development. In this thesis we aimed to contribute to the study of the fetal myogenesis defect in dyW mice in two ways: First, we asked what cell types produce laminins during fetal myogenesis. We performed a detailed analysis of laminin production and assembly in fetal muscles at stages preceding the onset of MDC1A. We found that mononucleated cells, including Pax7-positive cells, are a major source of laminins at the beginning of secondary myogenesis, but during later stages of secondary myogenesis, myofibers also express laminin genes. This suggests that Pax7-positive muscle stem cells play a major role in constructing the laminin microenvironment in the fetal muscles. We then used the Myf5cre-NICD mouse model (Mourikis et al., 2012) where Pax7-positive cells are unable to differentiate and thus do not form muscle fibers. We found that Pax7-positive cells at E14.5 produce and assemble laminins 211, 411 and 511, but at E17.5, the capacity to produce laminins is greatly diminished as they only produce laminin 511. These results indicate that Pax7-positive cells at E17.5 require the presence of myofibers to produce and assemble laminins 211 and 411. Second, since it is known that fetal myogenesis depends on innervation, we used the dyW mouse model, which has a mutation in the Lama2 gene, to assess the role of laminin 211/221 during neuromuscular junction development. We found that laminin 521 is closely assembled around the synapse, while laminins 421 is present, but does not seem to be in direct contact with the synapse. In the wildtype, laminin 221 has a distribution like laminin 421. However, our spatial analysis showed that α2-laminin deficient synapses tend to have a less clustered organization compared to wildtype ones and display a deficient AChR patterning. Based on these results, we hypothesize that laminin 221 might play a crucial role in NMJ development and that this may contribute to the onset of the fetal myogenesis defect in dyW mice. Together, our results provide new insights into laminin production and assembly during fetal muscle development and provide new indications into the mechanism underlying disease onset during development in utero in a mouse model for MDC1A.
MDC1A is a crippling neuromuscular disease caused by the absence of the α2-chain of laminins 211/221, major components of basement membranes. The onset of this disease during development in utero is marked by impaired muscle growth which correlates with a reduction in the number of mononucleated muscle cells in the fetal muscle masses (Nunes et al., 2017). Skeletal muscle development starts during early embryogenesis, when the dermomyotomal Pax3- and/or Pax7-positive muscle precursors cells are induced to enter the myogenic program and subsequently delaminate from the dermomyotome to form the myotome. Later on, when the dermomyotome dissociates, Pax3- and/or Pax7-positive muscle stem cells are released, some of which differentiate into myoblasts and fuse with myotomal cells or with each other, forming the primary myofibers during primary myogenesis that occurs between E11.5 and E14.5. The primary myofibers later serve as a scaffold for the formation of secondary myofibers and secondary myoblasts fuse with both primary and secondary myofibers to increase their size. Motor axons enter the muscle masses in parallel with primary myogenesis, but it is during secondary myogenesis (between E14.5 until birth) that the nerve contacts the muscle, and proper innervation is essential for normal fetal muscle development. During mid-secondary myogenesis, the Pax7-positive muscle stem cells become closely associated with the myofibers and their basement membrane. Laminin 211 and 221 are assembled around the adult myofiber and synaptic endplate, respectively, and are known to play important roles both in myofiber and neuromuscular junction development. In this thesis we aimed to contribute to the study of the fetal myogenesis defect in dyW mice in two ways: First, we asked what cell types produce laminins during fetal myogenesis. We performed a detailed analysis of laminin production and assembly in fetal muscles at stages preceding the onset of MDC1A. We found that mononucleated cells, including Pax7-positive cells, are a major source of laminins at the beginning of secondary myogenesis, but during later stages of secondary myogenesis, myofibers also express laminin genes. This suggests that Pax7-positive muscle stem cells play a major role in constructing the laminin microenvironment in the fetal muscles. We then used the Myf5cre-NICD mouse model (Mourikis et al., 2012) where Pax7-positive cells are unable to differentiate and thus do not form muscle fibers. We found that Pax7-positive cells at E14.5 produce and assemble laminins 211, 411 and 511, but at E17.5, the capacity to produce laminins is greatly diminished as they only produce laminin 511. These results indicate that Pax7-positive cells at E17.5 require the presence of myofibers to produce and assemble laminins 211 and 411. Second, since it is known that fetal myogenesis depends on innervation, we used the dyW mouse model, which has a mutation in the Lama2 gene, to assess the role of laminin 211/221 during neuromuscular junction development. We found that laminin 521 is closely assembled around the synapse, while laminins 421 is present, but does not seem to be in direct contact with the synapse. In the wildtype, laminin 221 has a distribution like laminin 421. However, our spatial analysis showed that α2-laminin deficient synapses tend to have a less clustered organization compared to wildtype ones and display a deficient AChR patterning. Based on these results, we hypothesize that laminin 221 might play a crucial role in NMJ development and that this may contribute to the onset of the fetal myogenesis defect in dyW mice. Together, our results provide new insights into laminin production and assembly during fetal muscle development and provide new indications into the mechanism underlying disease onset during development in utero in a mouse model for MDC1A.
Descrição
Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
Palavras-chave
Músculo-esquelético Lamininas Células estaminais Pax7+ Junção neuromuscular MDC1A Teses de mestrado - 2017