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Publicação
Low doses of ionizing radiation induce angiogenesis after radiotherapy
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Orientador(es)
Resumo(s)
Radiotherapy is a widely used local treatment for malignant tumors, characterized by uncontrolled growth and the ability of invading adjacent tissues and metastasize. However, clinical and experimental observations indicate that ionizing radiation (IR) might promote a metastatic behavior of cancer cells and that the irradiated host microenvironment might exert tumor-promoting effects. Therefore, a careful analysis of the putative tumor-promoting and pro-metastatic effect of IR is imperative, as radiotherapy is an essential part of cancer treatment. Different studies show the mechanisms by which IR activates cellular targets potentially contributing to invasion and metastasis. Doses of IR causing such stimulating effects are classically delivered inside the tumor target volume in daily small fractions, in order to limit the damage of healthy tissues and until a potentially curative dose has accumulated inside the tumor volume. Furthermore, the delivery in small fractions and the isodose distribution of external beam radiotherapy result in even lower doses of IR outside the tumor target volume. The molecular and biological effects of these low doses of IR on the surrounding tumor target remain to be determined.
Recently, we demonstrated in vitro and in vivo that low doses of IR promote tumor growth and metastasis by enhancing angiogenesis. Our work focused, in an innovative way, in the vasculature that surrounds the tumor and receives relatively low doses of IR. We found that low doses of IR promote tumor growth and metastasis in a Vascular Endothelial Growth Factor receptor (VEGFR) dependent manner.
Here, we addressed a clinically relevant issue of radiotherapy and investigated, for the first time, the effects of these low doses of IR on the vasculature surrounding the tumoral area, using material from patients with rectal cancer that received preoperative radiotherapy. Therefore, human tissue sections exposed to doses from 5 to 30 % of the therapeutic dose (100%), located in the vicinity of the tumor, were collected and the endothelial cells (ECs) isolated by using a laser capture microdissection (LCM) microscope. Then, RNA was extracted from these ECs in order to analyse the levels of expression of VEGFR2, Transforming growth factor B2 (TGF2), VEGFR1 and Angiopoietin2 (ANGPT2) by quantitative RT-PCR analysis. These levels of expression were compared with those obtained from ECs removed from human unirradiated tissues by using a similar methodology. This process of calibration is fundamental since we are comparing patients with different aging, secondary diseases, genetic and environmental background. As a control, we also analysed the levels of expression found in ECs removed from human mesorectum tissues that were exposed to the therapeutic doses.
The molecular targets selected in our study were previously identified in an in vitro microarray study performed by our team. From 28,869 genes represented on the array, 4,042 significantly changed with low dose IR and from those, VEGFR2, TGF2, VEGFR1 and ANGPT2 were selected as the best candidates for a pro-angiogenic response.
Our results obtained in patients between 41 and 65 years of age show that ECs removed from specimens irradiated with low doses of IR present a consistent increase of VEGFR2 and TGF2 expressions when compared to the levels found in unirradiated ECs. Concerning VEGFR1 and ANGPT2, the results were much more variable and these molecular targets may be down- or up-regulated or even not modulated as observed for the oldest patient analyzed (65 years old). Interestingly, our findings show that in comparison with the therapeutic dose, low doses of IR modulate differently the expression levels of VEGFR2, TGF2, VEGFR1 and ANGPT2.
During this study, we also identified two different types of parameters such as age (intrinsic parameter) and the number of weeks between the end of treatment and surgery (extrinsic parameter), that could influence the modulation of the angiogenic balance by low doses of IR.
In conclusion, our data suggest that 8 weeks after the end of the radiotherapy treatment, ECs that were exposed to low doses of IR have their angiogenic balance skewed toward a pro-angiogenic phenotype. This shift represents a mark that those ECs were submitted to a stimulus that led to an angiogenic response.
A radioterapia é usada no tratamento de tumores malignos caracterizados por um crescimento descontrolado e capacidade de invadir tecidos adjacentes e metastizar. Contudo, observações experimentais e clínicas indicam que a radiação ionizante (RI) poderá promover um comportamento metastático por parte das células tumorais e que o microambiente irradiado poderá promover a tumorigénese. Assim, é extremamente importante estudar os possíveis efeitos da RI promovendo o crescimento tumoral e metastização uma vez que a radioterapia é essencial no tratamento do cancro. Diferentes estudos identificam os mecanismos pelos quais a RI ativa alvos celulares contribuindo de forma significativa para a invasão e metastização. As doses de RI que causam estes efeitos são administradas diariamente, em pequenas frações, até que a dose potencialmente curativa seja acumulada no interior da área a tratar, com o objetivo de minimizar o dano provocado nos tecidos saudáveis. Para além disso, a administração em baixas doses e a distribuição homogénea das curvas de isodose em radioterapia de feixe externo contribuem para que existam ainda menores doses de RI fora da área a tratar. Os efeitos biológicos e moleculares destas baixas doses de RI nos tecidos que rodeiam a área a tratar são desconhecidos. Recentemente, demonstrámos que estas baixas doses de RI induzem angiogénese e consequentemente promovem o crescimento tumoral e metastização. Centrámo-nos, de forma inovadora, na vasculatura que rodeia o tumor e recebe relativamente baixas doses de RI. Mostrámos que baixas doses de RI promovem o crescimento tumoral e metastização através de um mecanismo dependente do recetor do fator de crescimento de endotélio vascular (VEGFR). Neste trabalho pretendemos focar um aspeto clínico relevante da radioterapia e investigar, pela primeira vez, o efeito de baixas doses de RI na vasculatura que rodeia a área tumoral, usando material recolhido de doentes com cancro de recto que tenham recebido radioterapia pré-operatória. Assim, secções de tecido humano submetidas a doses de 5 a 30% da dose terapêutica (100%), localizadas na proximidade do tumor, foram colecionadas e as células endoteliais (CEs) isoladas usando um microscópio de microdissecção a laser. Seguidamente, o RNA foi extraído destas mesmas células com o objetivo de analisar os níveis de expressão de VEGFR2, TGF2, VEGFR1 e ANGPT2 por meio de RT-PCR quantitativo. Estes níveis de expressão foram comparados com os níveis obtidos em CEs removidas de tecidos humanos não irradiados usando uma metodologia semelhante. Este processo é fundamental uma vez que pretendemos comparar doentes que poderão ter idades diferentes, outras doenças ou não, para além do tumor de reto, e estarem dependentes de fatores genéticos e ambientais diferentes. Como controlo, os níveis de expressão de CEs removidas de tecidos humanos correspondentes ao mesorecto e expostas com doses terapêuticas de RI (100%) foram também analisadas. Os alvos moleculares que foram selecionados no nosso trabalho foram previamente identificados a partir da nossa análise de «microarrays» realizada in vitro. De 28.869 genes representados no array, a expressão de 4.042 encontra-se significativamente alterada pelas baixas doses de RI. Destes últimos, VEGFR2, TGF2, VEGFR1 e ANGPT2 foram selecionados como os melhores candidatos para uma resposta pró-angiogénica. Os resultados obtidos em doentes com idades compreendidas entre os 41 e 65 anos mostram que CEs removidas de amostras irradiadas com baixas doses de RI apresentam de forma consistente, níveis de expressão de VEGFR2 e TGF2 superiores aos apresentados por CEs não irradiadas. No que diz respeito aos níveis de expressão de VEGFR1 e ANGPT2, estes são mais variáveis entre doentes e poderão estar aumentados, diminuídos ou mesmo não serem modulados, como acontece no doente de maior idade analisado (65 anos). Contudo é de realçar que os nossos resultados sugerem que em comparação com a dose terapêutica, as baixas doses de RI modulam diferencialmente os níveis de expressão de VEGFR2, TGF2, VEGFR1 e ANGPT2. Neste estudo identificámos também dois parâmetros, idade (parâmetro intrínseco) e o número de semanas decorridas entre o final da radioterapia e a cirurgia (parâmetro intrínseco), que poderão influenciar a modulação da balança angiogénica pelas baixas doses de RI. Em conclusão, os nossos resultados sugerem que 8 semanas após o final da radioterapia, as CEs expostas a baixas doses de RI têm a sua balança angiogénica desnivelada no sentido de uma resposta pró-angiogénica. Este desequilíbrio na balança angiogénica representa uma marca que aquelas CEs foram submetidas a um estímulo que conduziu a uma resposta angiogénica.
A radioterapia é usada no tratamento de tumores malignos caracterizados por um crescimento descontrolado e capacidade de invadir tecidos adjacentes e metastizar. Contudo, observações experimentais e clínicas indicam que a radiação ionizante (RI) poderá promover um comportamento metastático por parte das células tumorais e que o microambiente irradiado poderá promover a tumorigénese. Assim, é extremamente importante estudar os possíveis efeitos da RI promovendo o crescimento tumoral e metastização uma vez que a radioterapia é essencial no tratamento do cancro. Diferentes estudos identificam os mecanismos pelos quais a RI ativa alvos celulares contribuindo de forma significativa para a invasão e metastização. As doses de RI que causam estes efeitos são administradas diariamente, em pequenas frações, até que a dose potencialmente curativa seja acumulada no interior da área a tratar, com o objetivo de minimizar o dano provocado nos tecidos saudáveis. Para além disso, a administração em baixas doses e a distribuição homogénea das curvas de isodose em radioterapia de feixe externo contribuem para que existam ainda menores doses de RI fora da área a tratar. Os efeitos biológicos e moleculares destas baixas doses de RI nos tecidos que rodeiam a área a tratar são desconhecidos. Recentemente, demonstrámos que estas baixas doses de RI induzem angiogénese e consequentemente promovem o crescimento tumoral e metastização. Centrámo-nos, de forma inovadora, na vasculatura que rodeia o tumor e recebe relativamente baixas doses de RI. Mostrámos que baixas doses de RI promovem o crescimento tumoral e metastização através de um mecanismo dependente do recetor do fator de crescimento de endotélio vascular (VEGFR). Neste trabalho pretendemos focar um aspeto clínico relevante da radioterapia e investigar, pela primeira vez, o efeito de baixas doses de RI na vasculatura que rodeia a área tumoral, usando material recolhido de doentes com cancro de recto que tenham recebido radioterapia pré-operatória. Assim, secções de tecido humano submetidas a doses de 5 a 30% da dose terapêutica (100%), localizadas na proximidade do tumor, foram colecionadas e as células endoteliais (CEs) isoladas usando um microscópio de microdissecção a laser. Seguidamente, o RNA foi extraído destas mesmas células com o objetivo de analisar os níveis de expressão de VEGFR2, TGF2, VEGFR1 e ANGPT2 por meio de RT-PCR quantitativo. Estes níveis de expressão foram comparados com os níveis obtidos em CEs removidas de tecidos humanos não irradiados usando uma metodologia semelhante. Este processo é fundamental uma vez que pretendemos comparar doentes que poderão ter idades diferentes, outras doenças ou não, para além do tumor de reto, e estarem dependentes de fatores genéticos e ambientais diferentes. Como controlo, os níveis de expressão de CEs removidas de tecidos humanos correspondentes ao mesorecto e expostas com doses terapêuticas de RI (100%) foram também analisadas. Os alvos moleculares que foram selecionados no nosso trabalho foram previamente identificados a partir da nossa análise de «microarrays» realizada in vitro. De 28.869 genes representados no array, a expressão de 4.042 encontra-se significativamente alterada pelas baixas doses de RI. Destes últimos, VEGFR2, TGF2, VEGFR1 e ANGPT2 foram selecionados como os melhores candidatos para uma resposta pró-angiogénica. Os resultados obtidos em doentes com idades compreendidas entre os 41 e 65 anos mostram que CEs removidas de amostras irradiadas com baixas doses de RI apresentam de forma consistente, níveis de expressão de VEGFR2 e TGF2 superiores aos apresentados por CEs não irradiadas. No que diz respeito aos níveis de expressão de VEGFR1 e ANGPT2, estes são mais variáveis entre doentes e poderão estar aumentados, diminuídos ou mesmo não serem modulados, como acontece no doente de maior idade analisado (65 anos). Contudo é de realçar que os nossos resultados sugerem que em comparação com a dose terapêutica, as baixas doses de RI modulam diferencialmente os níveis de expressão de VEGFR2, TGF2, VEGFR1 e ANGPT2. Neste estudo identificámos também dois parâmetros, idade (parâmetro intrínseco) e o número de semanas decorridas entre o final da radioterapia e a cirurgia (parâmetro intrínseco), que poderão influenciar a modulação da balança angiogénica pelas baixas doses de RI. Em conclusão, os nossos resultados sugerem que 8 semanas após o final da radioterapia, as CEs expostas a baixas doses de RI têm a sua balança angiogénica desnivelada no sentido de uma resposta pró-angiogénica. Este desequilíbrio na balança angiogénica representa uma marca que aquelas CEs foram submetidas a um estímulo que conduziu a uma resposta angiogénica.
Descrição
Tese de mestrado, Oncobiologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014
Palavras-chave
Angiogénese Radiação ionizante Balança angiogénica Expressão génica Células endoteliais Teses de mestrado - 2014