Criopreservação de oócitos: efeito de diferentes protocolos na viabilidade pós-vitrificação

Abstract

A criopreservação de oócitos é uma técnica que embora apresentando taxas de sucesso muito baixas assume extrema importância nas questões relacionadas com a fertilidade humana, devido ao número crescente de doenças como o cancro, que podem conduzir à infertilidade. Por outro lado, contribui para a manutenção da biodiversidade e preservação das espécies em risco de extinção, onde a criopreservação de gâmetas e embriões é essencial. Este trabalho tem como objetivos aprofundar o conhecimento da fisiologia da criopreservação de oócitos e testar protocolos com crioprotetores (CPAs) diferentes. Foram avaliados os efeitos de dois protocolos de criopreservação contendo etilenoglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) e sucrose ou 1,2-propanediol (PROH) e sucrose, e o efeito da diminuição do cálcio (Ca2+) nos meios de vitrificação/aquecimento, em três experiências. Na experiência 1, os oócitos foram sujeitos ao processo de vitrificação enquanto na 2 foram sujeitos apenas ao processo de choque osmótico provocado pelos CPAs. Nestas experiências foi avaliado o efeito dos protocolos na viabilidade e posterior competência para o desenvolvimento dos oócitos após fertilização in vitro, em simultâneo com a avaliação do potencial de membrana mitocondrial, da localização dos grânulos corticais e do tempo de digestão da zona pelúcida (ZP) de oócitos. Na experiência 3, foram analisadas a composição lipídica e a permeabilidade da membrana dos oócitos submetidos ao choque osmótico mas não vitrificados. As taxas de desenvolvimento obtidas foram superiores para oócitos sujeitos ao protocolo com EG+DMSO, tanto na experiência 1 como na 2 (P≤0.04), independentemente da presença de Ca2+ no meio. Foi identificado um efeito mais acentuado do choque osmótico e/ou toxicidade aliados a um possível endurecimento precoce da ZP assim como, menores concentrações de C18:1c11, nos complexos cumulus oócito (COCs) dos grupos com PROH. A permeabilidade dos oócitos foi alterada pela exposição a este CPA e Ca2+ (P≤0.007). Assim conclui-se que o protocolo mais eficaz na criopreservação de oócitos bovinos é composto pela combinação dos CPAs EG+DMSO, independentemente da presença de Ca2+. No entanto, foi identificada uma interação entre os CPAs e o Ca2+em alguns parâmetros que deverá ser investigada.

Oocyte cryopreservation is a technique that still presents very low success rates. However it has extreme importance in issues related with human fertility due to the growing number of diseases such as cancer which can cause infertility. Additionally, it helps to maintain the biodiversity and preservation of endangered species in which the cryopreservation of gametes and embryos is essential. The focus of this paper is to implement a better understanding of the physiology of the oocyte cryopreservation and to test protocols with different cryoprotectors (CPAs). Two protocols were evaluated, one containing ethylene glycol (EG), dimethyl sulfoxide (DMSO) and sucrose while the other is composed by 1,2-propanediol (PROH) and sucrose. Both were submitted to a decrease on calcium (Ca2+) through vitrification, divided in three different experiments. On experiment 1, the oocytes were subjected to the vitrification process while on experiment 2 they were only submitted to the process of osmotic shock induced by the CPAs. In these experiments the effect of different protocols on the viability and posterior competence of the oocytes for development after IVF have been evaluated. The evaluation of the mitochondrial membrane potential, cortical granules location and zona pellucida (ZP) time of digestion was simultaneously performed. In experiment 3, the lipid composition and the membrane permeability of the oocytes submitted to the osmotic shock without vitrification were analyzed. Independently of the presence of Ca2+ on the culture medium, the obtained developmental rates were superior for the oocytes submitted to the EG+DMSO protocol, in both experiences 1 and 2 (P≤0.04). An increased effect of the osmotic shock and/or toxicity was identified probably associated to a premature hardening of the ZP as well as to lower concentrations of C18:1c11 on the cumulus oocytes complexes in the groups with PROH. The oocytes permeability was changed by the exposure to this CPA and Ca2+ (P≤0.007). In conclusion the most effective protocol for the cryopreservation of bovine oocytes is composed by the association of the CPAs EG+DMSO, independently of the presence of Ca2+. However, it was identified an interaction between the CPAs and the Ca2+ on some parameters that should be further investigated.