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Publicação
Splicing modulation to rescue the repair activity of a biallelic BRCA2 mutant in a patient derived cell line
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Resumo(s)
Através de splicing alternativo, um conjunto de transcritos de BRCA1 e BRCA2 expressos em células portadoras de variantes associadas ao cancro hereditário pode codificar proteínas internamente truncadas, mas funcionais. Até à data, uma análise sistemática da abundância e funcionalidade das proteínas resultantes de isoformas de splicing específicas ainda não foi realizada. Aqui, usámos a variante BRCA2:c.681+5G>C, que induz o skipping do exão 8, como modelo. Tirando proveito da alta precisão e sensibilidade do “One-step droplet digital RT-PCR” (ddRT-PCR), identificámos e quantificámos duas isoformas de mRNA específicas da variante expressas em células homozigóticas para a variante alélica. A isoforma de transcrito mais abundante apresenta alteração do quadro de leitura, a qual gera um codão de terminação prematuro (PTC) resultando na sua degradação por “nonsense-mediated mRNA decay” (NMD). Uma isoforma alternativa, menos abundante, foi identificada. Esta apresenta recuperação do quadro de leitura, prevendo-se que codifique uma proteína internamente truncada, sem domínios não essenciais. No entanto, apesar da presença da proteína BRCA2, avaliada por “WesternBlot”, as células portadoras da variante em homozigotia apresentam defeitos na reparação do DNA. Para testar a hipótese de que a isoforma de splicing menor não produz proteína BRCA2 com capacidade funcional suficiente, usámos edição genómica mediada por CRISPR-Cas9 para induzir o “skipping” do exão 7 nas células mutantes, visando a produção de transcritos com o quadro de leitura corrigido. Em comparação com as células derivadas dos doentes, as células editadas geneticamente formaram significativamente mais focos de RAD51 após exposição ao etoposido e mostraram significativamente menos quebras cromossómicas induzidas por mitomicina C. Estes resultados apresentam uma evidência para o potencial terapêutico da modulação de “splicing”, através da indução da produção de transcritos com o quadro de leitura correto mesmo que truncados em alguns exões não essenciais, como estratégia para resgatar a função de BRCA2 em células mutantes, prevenindo assim o desenvolvimento de cancro.
Through alternative splicing, a subset of BRCA1 and BRCA2 transcripts expressed in cells harboring genetic variants associated with hereditary cancer may encode internally truncated, yet functional proteins. To date, a systematic analysis of variant-specific splicing isoform abundance and functionality of the encoded protein has not been performed. Here, we used the BRCA2 c.681+5G>C variant, which induces skipping of exon 8, as a model system. Taking advantage of the high precision and sensitivity of Onestep droplet digital RT-PCR (ddRT-PCR), we identified and quantified two variant-specific mRNA isoforms expressed in cells homozygous for the variant allele. The most abundant transcript is out-of-frame, contains a premature termination codon (PTC) and is targeted for degradation by the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway. A less abundant isoform maintains the reading frame and is predicted to encode an internally truncated protein lacking non-essential domains. However, despite the presence of BRCA2 protein, as assessed by immunoblot, homozygous mutant cells were defective in DNA repair. To test the hypothesis that the minor splicing isoform does not produce sufficient BRCA2 activity level, we used CRISPR-Cas9 gene editing to induce skipping of exon 7 in mutant cells, thereby increasing the expression of in-frame transcripts. Compared to the parental patient-derived cells, the gene-edited cells formed significantly more RAD51 foci after exposure to etoposide and showed significantly less chromosome breaks induced by mitomycin C. These results provide evidence for the therapeutic potential of splicing modulation, by inducing the expression of in-frame transcripts that lack non-essential exons, as a strategy to rescue BRCA2 function in mutant cells, thereby preventing the development of cancer.
Through alternative splicing, a subset of BRCA1 and BRCA2 transcripts expressed in cells harboring genetic variants associated with hereditary cancer may encode internally truncated, yet functional proteins. To date, a systematic analysis of variant-specific splicing isoform abundance and functionality of the encoded protein has not been performed. Here, we used the BRCA2 c.681+5G>C variant, which induces skipping of exon 8, as a model system. Taking advantage of the high precision and sensitivity of Onestep droplet digital RT-PCR (ddRT-PCR), we identified and quantified two variant-specific mRNA isoforms expressed in cells homozygous for the variant allele. The most abundant transcript is out-of-frame, contains a premature termination codon (PTC) and is targeted for degradation by the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway. A less abundant isoform maintains the reading frame and is predicted to encode an internally truncated protein lacking non-essential domains. However, despite the presence of BRCA2 protein, as assessed by immunoblot, homozygous mutant cells were defective in DNA repair. To test the hypothesis that the minor splicing isoform does not produce sufficient BRCA2 activity level, we used CRISPR-Cas9 gene editing to induce skipping of exon 7 in mutant cells, thereby increasing the expression of in-frame transcripts. Compared to the parental patient-derived cells, the gene-edited cells formed significantly more RAD51 foci after exposure to etoposide and showed significantly less chromosome breaks induced by mitomycin C. These results provide evidence for the therapeutic potential of splicing modulation, by inducing the expression of in-frame transcripts that lack non-essential exons, as a strategy to rescue BRCA2 function in mutant cells, thereby preventing the development of cancer.
Descrição
Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024
Palavras-chave
Genes BRCA2 Modulação de splicing VUS Proteína 9 associada à CRISPR Biologia molecular