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Publicação
Functional and dynamic studies on bacterial two-component signal transduction systems with focus on sensor histidine kinases and their sensor domains
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
A comunicação microbiana é um processo essencial que regula vários mecanismos fisiológicos
importantes, como a virulência, a formação de biofilmes e a resistência a antibióticos. Essa capacidade de
coordenação entre microrganismos exerce um impacto profundo na sua adaptação ao ambiente, tornandose, por isso, um tema central de estudo na microbiologia. Nesse contexto, os sistemas de dois
componentes (TCS) desempenham um papel central. Estes, permitem que as bactérias tenham capacidade
de resposta a uma ampla gama de estímulos ambientais, como variações de temperatura, pressão
osmótica, pH, e presença de compostos antimicrobianos.
Os TCS, como o próprio nome indica, são formados por dois componentes: a cinase de histidina (HK) e o
regulador de resposta (RR). A HK, localizada geralmente na membrana celular, recebe o estímulo
ambiental e autofosforila numa histidina, que é conservada. Posteriormente, o grupo fosforil é transferido
para um aspartato no RR, ativando-o e permitindo que regule a expressão de genes específicos (Papon &
Stock, 2019; Stock et al., 2000). Apesar de sua importância para a adaptação e sobrevivência bacteriana,
os detalhes estruturais e funcionais desses sistemas ainda não foram totalmente elucidados, limitando a
compreensão de como a especificidade e a regulação desses mecanismos são influenciadas por diferentes
sinais ambientais. Embora técnicas como cristalografia de raios-X, ligações cruzadas com cisteína,
espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) e simulações de dinâmica molecular tenham
fornecido modelos iniciais sobre as interações entre a HK e o RR, o conhecimento completo dos
mecanismos regulatórios ainda está por alcançar. Isso resulta numa compreensão limitada da fisiologia
bacteriana, particularmente no que diz respeito a processos como a regulação de genes envolvidos na
resistência a antibióticos ou na formação de biofilmes.
O sistema de dois-componentes, SpaK (HK) e SpaR (RR) é importante para a deteção e regulação do
lantibiótico subtilina, produzido por Bacillus subtilis. No entanto, os detalhes estruturais da interação
entre a SpaK e a subtilina continuam a ser pouco compreendidos, em parte devido à ausência de dados
estruturais tanto da SpaK isolada como do complexo SpaK-subtilina.
O foco desta tese é a interação entre a cinase de histidina SpaK e o regulador de resposta SpaR,
desencadeada pela ligação do domíno sensor (SD) SpaK com a subtilina. A subtilina é um lantibiótico –
uma classe de antibióticos peptídicos produzidos por bactérias que desempenha um papel crucial na
comunicação interbacteriana e na regulação de funções essenciais, como a resistência a antibióticos.
O objetivo principal deste trabalho foi identificar resíduos críticos envolvidos na interação com a subtilina
através da medição da atividade da proteína SpaK selvagem (WT). Um modelo da SpaK gerado pelo
AlphaFold2 guiou simulações de dinâmica, permitindo identificar resíduos de aminoácidos importantes
na ligação à subtilina. Posteriormente, foi realizada a técnica de alanine scanning com os aminoácidos
identificados como importantes para a interação proteina-péptido, na qual os resíduos do SD da SpaK
foram sistematicamente substituídos por alanina. Essa abordagem permitiu avaliar quais resíduos são
fundamentais para a ligação com a subtilina e determinar se as alterações na atividade de β-galactosidase
observadas resultam de uma interrupção na ligação ou de outros fatores, como o enovelamento incorreto
da proteína. Para gerar mutantes de SpaK, foi utilizada a técnica de mutagénese sítio-dirigida. Estes
mutantes foram analisados usando ensaios de β-galactosidase.
O ensaio de β-galactosidase é uma ferramenta bem estabelecida para medir a atividade de interações
proteína-substrato em células bacterianas. Ao medir a atividade enzimática da β-galactosidase, é possível correlacionar a presença ou ausência de ligação com mudanças na atividade do sistema SpaK e SpaR, o
que, por sua vez, permite identificar resíduos chave envolvidos no reconhecimento da subtilina. Os
mutantes foram analisados usando ensaios de β-galactosidase, que revelaram que resíduos específicos,
como E53 e L102, são importantes para a ligação à subtilina. A mutação L102A, por exemplo, reduziu
significativamente a atividade de β-galactosidase induzida pela subtilina, destacando a importância deste
resíduo no reconhecimento do substrato. Em contraste, a mutação E53A tornou a SpaK não funcional,
sublinhando o papel crucial deste resíduo na atividade da proteína.
E53 pode formar uma ponte salina com R54, estabilizando a interação entre os monómeros, mas a
mutação E53A interrompe essa função, resultando na perda de atividade com subtilina. A distância
excessiva entre E53 e R54 no modelo AF2 sugere que a flexibilidade do dímero de SpaK permite
aproximações necessárias para a interação. Um paralelo é traçado com a cinase de histidina PhoQ, que
utiliza interações polares semelhantes para estabilizar sua estrutura, apesar da falta de conservação de
sequência entre SpaK e PhoQ.
O resíduo hidrofóbico L102 também é crucial para o funcionamento de SpaK. A mutação de L102 para
alanina enfraquece a interação com subtilina, interferindo na transdução do sinal. Devido à diversidade
estrutural das cinases de histidina, mais ensaios são necessários para conhecer o papel exato de L102.
Para entender melhor as funções de E53 e L102 e suas interações com subtilina, são sugeridas técnicas
avançadas, como cristalografia de raios-X.
A análise da resposta à dose mostrou que, embora algumas mutações aumentassem a afinidade de ligação
da subtilina, elas comprometiam a atividade máxima de β-galactosidase, sugerindo um equilíbrio entre
afinidade de ligação e a função biológica do sistema, como o que se observa em outros sistemas de dois
components como PhoQP. Além disso, foi testado um substrato não nativo, o lantibiótico nisina A, que
não ativou o sistema SpaK-SpaR, confirmando a especificidade da SpaK pela subtilina.
Outro foco deste estudo, além dos estudos funcionais, foi o estabelecimento de um protocolo de
purificação da SpaK, visando possibilitar investigações estruturais mais detalhadas desta proteína. Como
o foco principal está no domínio sensor, que não é solúvel, a proteína SpaK foi purificada juntamente com
os domínios sensor e transmembranar (Spak SD + TM). A purificação de proteínas é uma etapa
fundamental para a análise das suas propriedades bioquímicas e funcionais, especialmente no caso de
proteínas integrais de membrana, como a SpaK, que apresentam desafios técnicos adicionais devido à sua
localização e função na membrana celular.
Foram realizados testes com diferentes detergentes, incluindo DDM, LMNG e DM, para otimizar a
solubilização da SpaK. A escolha de detergentes adequados foi fundamental para manter a conformação
nativa da proteína enquanto se tentou cristalizá-la, um passo importante para obter uma visão detalhada da
sua estrutura tridimensional. Detergentes como LDAO e OG também foram considerados para otimizar as
condições de cristalização. Os ensaios preliminares de cristalografia de raios-X com detergentes DDM e
DM mostraram resultados promissores. A próxima etapa será tentar co-cristalizar a SpaK juntamente com
a subtilina, o que poderia revelar detalhes cruciais sobre o mecanismo de interação entre essas moléculas
e melhorar o conhecimento sobre a sinalização bacteriana.
Estudos estruturais subsequentes focaram na otimização do processo de solubilização e purificação do
complexo SpaK SD + TM. Foram testados vários detergentes, como DDM, LMNG e DM, que
apresentaram resultados promissores na purificação da proteína. LDAO e OG foram sugeridos para otimização adicional. A co-cristalização do complexo SpaK com a subtilina poderia fornecer uma visão
detalhada da sua estrutura e mecanismos de interação, contribuindo para uma melhor compreensão da
sinalização bacteriana.
Compreender o comportamento microbiano e os mecanismos de sinalização é crucial para o
desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e biotecnológicas. Além disso, tal compreensão pode
ter um impacto significativo em problemas globais, como a resistência a antimicrobianos e a
sustentabilidade agrícola. Ao melhorar o nosso conhecimento sobre a comunicação microbiana, esta
pesquisa visa avanços nas aplicações médicas e ambientais, incluindo o controlo de patógenos e
inovações na biotecnologia.
Microbial communication is essential for regulating bacterial behavior, influencing processes like virulence, biofilm formation, and antibiotic resistance. Two-component systems (TCS) are central to this communication, allowing bacteria to sense and respond to environmental stimuli such as osmotic pressure, pH changes, and antimicrobial compounds. Despite their significance, the structural and functional details of TCS remain poorly understood. While previous studies using X-ray crystallography, cysteine cross-linking, and molecular dynamics simulations have provided insights into sensor histidine kinase (HK) and response regulator (RR) interactions, a comprehensive understanding of these mechanisms is still lacking. In Bacillus subtilis, the SpaKR system, composed of the histidine kinase SpaK and the response regulator SpaR, is critical for detecting and regulating the lantibiotic subtilin. However, the structural details of SpaK’s interaction with subtilin remain unclear. Using an AlphaFold2 model of SpaK, molecular dynamics simulations and docking studies identified key residues potentially involved in subtilin binding. Alanine scanning mutagenesis was employed to systematically replace amino acids within SpaK's sensor domain (SD), through site directed mutagenisis, to assess their roles in subtilin interaction. Mutations in residues E53 and L102 are crucial for SpaK’s function. The L102A mutation reduced subtilin-induced activity, while E53A rendered SpaK non-functional. These residues stabilize SpaK and facilitate subtilin binding, with alanine mutations disrupting key interactions. In parallel, a purification protocol for SpaK was developed to enable structural studies. Given the challenges in working with full-length SpaK, a modular approach focused on the sensor domain (SD) and transmembrane (TM) regions. Detergents such as DDM, LMNG, and DM were tested for solubilization, and initial X-ray crystallography trials were conducted. LDAO and OG detergents are recommended for optimizing crystallization, aiming to obtain high-quality structural data. These studies aim to improve understanding of microbial signaling with applications in therapeutics, pathogen control, and biotechnology.
Microbial communication is essential for regulating bacterial behavior, influencing processes like virulence, biofilm formation, and antibiotic resistance. Two-component systems (TCS) are central to this communication, allowing bacteria to sense and respond to environmental stimuli such as osmotic pressure, pH changes, and antimicrobial compounds. Despite their significance, the structural and functional details of TCS remain poorly understood. While previous studies using X-ray crystallography, cysteine cross-linking, and molecular dynamics simulations have provided insights into sensor histidine kinase (HK) and response regulator (RR) interactions, a comprehensive understanding of these mechanisms is still lacking. In Bacillus subtilis, the SpaKR system, composed of the histidine kinase SpaK and the response regulator SpaR, is critical for detecting and regulating the lantibiotic subtilin. However, the structural details of SpaK’s interaction with subtilin remain unclear. Using an AlphaFold2 model of SpaK, molecular dynamics simulations and docking studies identified key residues potentially involved in subtilin binding. Alanine scanning mutagenesis was employed to systematically replace amino acids within SpaK's sensor domain (SD), through site directed mutagenisis, to assess their roles in subtilin interaction. Mutations in residues E53 and L102 are crucial for SpaK’s function. The L102A mutation reduced subtilin-induced activity, while E53A rendered SpaK non-functional. These residues stabilize SpaK and facilitate subtilin binding, with alanine mutations disrupting key interactions. In parallel, a purification protocol for SpaK was developed to enable structural studies. Given the challenges in working with full-length SpaK, a modular approach focused on the sensor domain (SD) and transmembrane (TM) regions. Detergents such as DDM, LMNG, and DM were tested for solubilization, and initial X-ray crystallography trials were conducted. LDAO and OG detergents are recommended for optimizing crystallization, aiming to obtain high-quality structural data. These studies aim to improve understanding of microbial signaling with applications in therapeutics, pathogen control, and biotechnology.
Descrição
Tese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Comunicação microbiana Sistemas de dois componentes Cinase de histidina Ligação de substrato e lantibióticos Teses de mestrado - 2025