Early detection of T cell exhaustion by microcalorimetry

Nunes, Rui Miguel Furtado

http://hdl.handle.net/10400.5/98502

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Authors

Nunes, Rui Miguel Furtado

Advisor(s)

Antunes, Fernando José Nunes

Piedade, Manuel Eduardo Ribeiro Minas da

Abstract(s)

A resposta imunitária é a capacidade do sistema imunitário, de reagir a moléculas reconhecidas como estranhas ou anómalas, protegendo o organismo de células tumorais ou agentes externos que comprometem a homeostasia, como patógenos. A resposta imunitária divide-se em resposta inata e adaptativa. A resposta inata, apesar de pouco especifica, é essencial nas primeiras horas de infeção e na ativação da resposta adaptativa. A resposta adaptativa é mediada por linfócitos e seus produtos e, apesar de só atuar após alguns dias de infeção, permite uma ação extremamente específica e eficaz na eliminação de patógenos. Os linfócitos B eliminam patógenos extracelulares através da secreção de anticorpos, um processo conhecido por resposta humoral. Os linfócitos T eliminam patógenos intracelulares e células tumorais, e participam na ativação de macrófagos para eliminação de patógenos fagocitados, o que corresponde à chamada imunidade mediada por células. Os linfócitos T diferenciam-se no timo a partir de células progenitoras geradas na medula óssea. Após o processo de diferenciação, os linfócitos T maduros migram para órgãos linfoides secundários, onde são ativados na presença de um antigénio (molécula encontrada em patógenos, células tumorais, ou mesmo células endógenas que são reconhecidas por linfócitos e desencadeiam uma resposta imunitária adaptativa). A ativação destas células leva a alterações transcricionais e metabólicas que permitem aos linfócitos T proliferarem rapidamente e diferenciaram-se em linfócitos efetores, que atuam na eliminação de infeções e células tumorais. Após eliminação de uma infeção, a maior parte dos linfócitos efetores sofre apoptose, mas alguns persistem e diferenciam-se em células de memória, capazes de sobreviver na ausência de antigénio e montar respostas mais eficientes a antigénios encontrados anteriormente. Contudo, em infeções crónicas ou cancro, a estimulação persistente com antigénio, em conjunto com coestimulação inibitória, e sinais de regulação negativa mediados por citocinas leva ao desenvolvimento ineficiente de memória. Nesses casos, as células desenvolvem um estado de disfunção designado exaustão celular. A exaustão de linfócitos T é caracterizada por proliferação reduzida e perda progressiva de capacidades efetoras, podendo culminar em morte celular. Linfócitos T exaustos apresentam também alterações ao nível transcricional, epigenético e metabólico, e disfunção ao nível mitocondrial. O microambiente tumoral é particularmente propício ao desenvolvimento de exaustão celular, e este processo é muitas vezes responsável por um combate ineficiente a tumores. A exaustão celular limita também as possibilidades de sucesso de imunoterapias que recorrem a células T com recetor quimérico de antigénio (células CAR-T), linfócitos T do paciente geneticamente modificados para reconhecer antigénios tumorais. Como tal, existem também imunoterapias que tentam revigorar linfócitos T exaustos, recorrendo a inibidores de checkpoint imunológico, que inibem sinais de regulação negativa que promovem a exaustão. Devido ao impacto que a exaustão de linfócitos T tem no contexto clínico, um biomarcador capaz de detetar este processo precocemente e monitorizar imunoterapias de forma não invasiva seria uma mais valia. Este trabalho teve como objetivo desenvolver um biomarcador que detete exaustão de linfócitos T de forma precoce. Para isso células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de buffy coats doados pelo Instituto Português do Sangue e Transplantação (IPST). Após um período de criopreservação, os linfócitos T nestas amostras foram ativados múltiplas vezes com anticorpos anti CD3/CD28, de forma a simular a estimulação antigénica persistente que leva à exaustão. O biomarcador foi medido em amostras reativadas múltiplas vezes e em amostras submetidas apenas a uma estimulação inicial de 3 dias, que serviram de controlo. Foi seguida também a proliferação celular, visto que uma proliferação reduzida é indicativa de disfunção celular e característica de exaustão. A expressão de marcadores de exaustão foi também monitorizada através de citometria de fluxo. Este é o método atualmente usado na clínica para deteção de exaustão de linfócitos T, e permite garantir que os linfócitos T presentes na amostra desenvolveram exaustão. Além disso, serve de referência para determinar se o biomarcador é mais sensível e consegue detetar exaustão de forma mais precoce. Os marcadores de exaustão seguidos foram a proteína de morte celular programada 1 (PD-1), o gene 3 de ativação linfocitária (LAG-3), a imunoglobulina de células T e domínio 3 da mucina (TIM-3), e o cluster de diferenciação 39 (CD39). Observou-se que os linfócitos T reativados apresentavam maior expressão de todos estes marcadores de exaustão relativamente a linfócitos controlo, ativados apenas uma vez. A expressão de PD-1 encontrava-se aumentada 1,7±0,1 vezes após a primeira reativação e 1,6±0,3 após quatro reativações, em linfócitos reativados comparativamente com linfócitos controlo. Já a expressão de LAG-3 encontrava-se aumentada 3,4±0,4 vezes após a primeira reativação e 6,2±0,7 após quatro reativações. Relativamente à expressão de TIM-3, observou-se um valor 2,1±0,4 vezes mais elevado nos linfócitos reativados após a primeira reativação e 2,1±0,6 após quatro reativações. Finalmente, a expressão de CD39 foi 5,2±2,9 vezes maior em células reativadas após três reativações e 9,9±6,3 após quatro reativações. Para além disso, amostras de PBMCs com linfócitos reativados apresentaram também uma redução na proliferação e uma alteração do biomarcador. A proliferação cumulativa de células controlo ao fim de sete dias correspondeu a 461% do número inicial de células, enquanto para as células reativadas este valor foi de apenas 167%. O biomarcador foi alterado após as reativações. A maior expressão de marcadores de exaustão associada à proliferação reduzida confirmou o desenvolvimento deste estado de disfunção nos linfócitos reativados. O facto de o desenvolvimento de exaustão nestes linfócitos estar associado a uma alteração do biomarcador demonstra que este consegue detetar exaustão de linfócitos T. Além disso, estas alterações no biomarcador foram detetadas no dia a seguir à primeira reativação, confirmando uma deteção precoce da exaustão, mas não mais precoce que a expressão de marcadores de exaustão observada por citometria de fluxo, que também já se encontrava alterada neste momento. Surpreendentemente, células reativadas após um período sem ativação, apesar de expressarem menos CD39, têm o biomarcador alterado e proliferaram menos que células continuamente reativadas. Deste modo, observou-se um aumento de 9,6±5,9 em células reativadas após descanso e apenas 2,3±0,0 em células reativadas sem qualquer descanso na expressão de CD39 relativamente a células controlo. Registou-se ainda uma diminuição do número de células descansadas em -32±7%, 24 horas após reativação e um aumento em 38±30% do número de células reativadas no mesmo intervalo de tempo. Conclui-se que ativação após um descanso leva a stress celular e viabilidade reduzida que são detetados pelo biomarcador, mas não pelos marcadores de exaustão. O biomarcador consegue ainda seguir a recuperação funcional de células reativadas após a interrupção do processo de reativação, ao contrário da citometria de fluxo. Adicionalmente, foi observada uma correlação entre o número de células após descongelamento e o biomarcador por células que apenas sofreram uma ativação inicial após quatro dias sem ativação. Este resultado sugere que um processo de isolamento, criopreservação e descongelamento menos eficiente, que leva a número menor de células e reduz a sua viabilidade e capacidades efetoras também se traduz num valor alterado do biomarcador. Em conclusão, este trabalho permitiu demonstrar que o biomarcador consegue detetar não só exaustão, mas também outras condições que reduzem a fitness das células e podem comprometer terapias com células CAR T, o que constitui uma vantagem relativamente à monitorização da expressão de marcadores de exaustão por citometria de fluxo, que apenas permite detetar exaustão celular. O biomarcador pode também ser usado para monitorizar o progresso de imunoterapias com inibidores de checkpoint na recuperação de linfócitos T do paciente. Futuramente, poder-se-ão realizar medidas do biomarcador em linfócitos T isolados, garantido assim que o sinal obtido provém apenas deste tipo de células e não de outras PBMCs. Convém, no entanto, notar que estas experiências seriam cegas ao efeito de interações entre linfócitos T e outras células que ocorrem in vivo e têm impacto no processo de exaustão celular.

T cell exhaustion is a state of dysfunction characterized by reduced proliferation, increased expression of inhibitory receptors, and progressive loss of effector functions. The main driver of this dysfunctional state is persistent antigen stimulation, which happens in chronic infections and cancer. This state of dysfunction impairs the immune response against cancer and leads to chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy failure. As such one immunotherapeutic approach consists in using immune checkpoint inhibitors to reinvigorate exhausted T cells. The goal of this work was to identify a biomarker that is effective for early detection of T cell exhaustion. With that objective in mind, T cells in a peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) sample were activated multiple times with anti-CD3/CD28 antibodies to mimic persistent antigen stimulation and compared with cells that underwent a single activation. Expression of exhaustion markers was monitored by flow cytometry, to ensure that T cells were becoming exhausted. Indeed, reactivated cells presented increased expression of exhaustion markers, confirming the development of an exhausted phenotype. The biomarker was changed in exhausted cells and, in cells that were exposed to other conditions that compromise cell fitness. Additionally, the biomarker was able to monitor recovery from such conditions. As such, it is possible to conclude that the biomarker detects T cell exhaustion. Furthermore, it can also be used to detect other conditions that may compromise success of CAR T cell therapy and to monitor T cell reinvigoration upon treatment with immune checkpoint inhibitors.