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Publicação
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The development of a direct competitive ELISA for the determination of histamine in wine
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
The presence of biogenic amines in wines, specifically the histamine (0,1 mg/L to 20 mg/L) has been a constant source of concern for wine producers, since this substance presents toxic effects for human beings.
The goal of this work was the development of a fast, efficient and low cost technique for the determination and quantification of histamine in wine. For that end, the strategy was the use of a competitive ELISA method.
The first step for the development of this method was the acquisition of the antibody for histamine. Among the available options, it was decided to purchase the commercial polyclonal antibody for histamine.
The second step was the conjugation of the histamine with the peroxidase. Three methods of conjugation were performed, followed by their subsequent analysis.
Initially, it was necessary to perform assays for the optimization of the antibody and of the conjugate, as well as to test the blocking buffers (1,0% (w/v) gelatin and 0,5% (w/v) sodium caseinate).
Before the application of the ELISA competitive method, auxiliary tests such as indirect ELISA, ELISA inhibition test and ELISA binding test were performed. However, continuously unsatisfactory results were obtained, leading to the perception that there could be a low efficiency of the conjugation processes and/or a lack of specificity between the histamine used and the polyclonal antibody acquired for the assays.----------------------------------------A presença de aminas biogénicas em vinhos, especificamente a histamina (0,1 mg/L a 20 mg/L) tem sido uma constante preocupação para o mercado vinícola, já que esta substância apresenta efeitos tóxicos para seres humanos.
O objectivo do presente trabalho foi desenvolver uma técnica rápida, eficaz e de baixo custo para a determinação e quantificação de histamina em vinhos. Para esse fim, foi proposto o método ELISA competitivo.
O primeiro passo para o desenvolvimento do método foi a obtenção do anticorpo anti- histamina. De entre as alternativas existentes, optou-se pela compra de um anticorpo policlonal.
O segundo passo foi a conjugação da histamina com a peroxidase. Foram feitos três processos de conjugação, seguidos de suas respectivas análises.
Inicialmente, foram realizados ensaios para a optimização do anticorpo e do conjugado, assim como foram testados dois tampões de bloqueio (1,0% (p/v) gelatina e 0,5% (p/v) caseinato de sódio).
Anteriormente à aplicação do método ELISA competitivo, foram realizados ensaios como ELISA indirecto, ELISA inhibition test e o ELISA binding test. Porém, os resultados foram pouco satisfatórios indicando uma possível falha no processo de conjugação e/ou baixa especificidade da histamina com o anticorpo utilizado.
Descrição
Mestrado em Engenharia Alimentar - Instituto Superior de Agronomia
Palavras-chave
wine histamine HRP antibody ELISA vinho histamina peroxidase