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Bacterial persistence and antibiotic resistance
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Orientador(es)
Resumo(s)
Quando populações de bactérias geneticamente sensíveis a um antibiótico bactericida são expostas a
esse composto, as células não morrem de forma instantânea. Inicialmente, observa-se uma fase de morte
exponencial, na qual a maioria das células é eliminada, levando a uma redução significativa do tamanho
populacional. No entanto, segue-se uma segunda fase distinta, durante a qual uma subpopulação residual
de células sobrevive por períodos consideravelmente mais longos. Nesta fase, o declínio do número
populacional ocorre de forma muito mais lenta, dando a impressão de que estas células são
geneticamente resistentes ao antibiótico, embora, na realidade, não o sejam. Esta segunda fase deve-se
a um fenómeno denominado de persistência, caracterizado por um estado de dormência em que células
com baixa atividade metabólica e taxa de crescimento conseguem sobreviver à exposição a agentes
citotóxicos, como os antibióticos. Contudo, estas células diferem das células resistentes, pois ao
dividirem-se, acabam por morrer. A sua capacidade de sobrevivência ao agente citotóxico está limitada
ao período em que permanecem neste estado de dormência.
O fenómeno da persistência foi descoberto há mais de 80 anos. No entanto, as suas causas moleculares,
fisiológicas e evolutivas permanecem ainda por esclarecer. A maioria dos investigadores que estuda este
fenómeno considera que a persistência tem uma base genética que terá evoluído especificamente para a
sobrevivência em certas condições de stress, como por exemplo exposição a compostos citotóxicos.
Contudo, outros investigadores têm usado argumentos evolutivos, matemáticos e experimentais para
defender a hipótese que a persistência não tem uma base genética específica. De acordo com esta
segunda hipótese a persistência resulta de erros aleatórios que ocorrem durante a divisão celular, e é
apenas a consequência direta da incapacidade temporária de algumas células retomarem as divisões
celulares, sendo estas células temporariamente incapazes de se replicar, e também temporariamente
refratárias aos antibióticos. Esta hipótese foi recentemente corroborada com resultados experimentais
realizados com uma estirpe bacteriana contendo um plasmídeo, não sendo claro qual o papel deste
elemento extra-cromossómico. Outra hipótese, mais recentemente formulada, que tenta explicar a
persistência, congrega ambas as perspetivas das duas hipóteses que a antecederam. Segundo esta nova
hipótese a persistência é o resultado da disrupção aleatória de grandes redes biomoleculares, em vez da
ativação de vias génicas específicas. Apesar disto, aquando do estudo de células persistentes, os
investigadores tendem a encontrar perturbações em certas vias génicas que surgem mais frequentemente
alteradas. Nomeadamente, em genes correlacionados com: módulos toxina-antitoxina; resposta ao
stress; reparação de danos no DNA; regulação do metabolismo; comunicação celular; sistemas de
bombas de efluxo e modificações epigenéticas.
Devido à capacidade de retomar o crescimento após o cessar dos tratamentos e do ambiente estar livre
de antibióticos, nos últimos anos as células persistentes têm vindo a ser reconhecidas pela comunidade
científica como uma das maiores causas do insucesso destas terapias e da recorrência de doenças
infeciosas bacterianas. Contudo, a resistência a antibióticos continua a ser o maior obstáculo ao combate
e eliminação destas infeções, dado que a mesma se encontra imensamente dispersada pelas comunidades
microbianas, sendo facilmente adquirida e desenvolvida pelas bactérias. Dado este contexto, este estudo
foi desenvolvido com o principal objetivo de estudar o impacto de mutações cromossómicas e de
plasmídeos, conferentes de resistência a diferentes antibióticos, no decaimento de uma população
bacteriana e na sua subpopulação de células persistentes, quando submetidas a um antibiótico
(ampicilina) para o qual não possuem resistência. Para isto, utilizámos estirpes de Escherichia coli K12,
com mutações pontuais no seu cromossoma bacteriano que conferem resistência a antibióticos com
mecanismos de ação diferentes dos da ampicilina, nomeadamente o ácido nalidíxico e/ou a rifampicina,
e/ou com plasmídeos isolados naturais (RN3 e R702) que conferem resistência a outros antibióticos que não a ampicilina. Como controlo, utilizámos uma estirpe derivada de E. coli K12 que não é resistente a
antibióticos nem contém qualquer plasmídeo.
Ao analisar curvas de morte de bactérias, de acordo com argumentos matemáticos, é esperado que as
populações bacterianas decaiam numa primeira fase de forma rápida e exponencial. Contudo, numa
segunda fase, quando apenas se mantêm vivas as subpopulações de células persistentes, é esperado que
estas decaiam mais lentamente e de acordo com uma distribuição exponencial ou de lei de potência se a
persistência tiver ou não uma base genética, respetivamente. Dado isto para além do objetivo principal
acima descrito, esta tese teve ainda como objetivo secundário o estudo matemático das cinéticas de
morte das populações bacterianas na primeira e segunda fase do seu decaimento. E desta forma avaliar
quais das duas distribuições matemáticas (exponencial ou lei de potência) melhor descreve o decaimento
das subpopulações de células persistentes.
Para analisar as cinéticas de morte das diferentes bactérias acima listadas foram realizados vários
ensaios de curva de morte. Estes ensaios consistiram na adição de um antibiótico (ampicilina) para o
qual as células bacterianas não apresentavam resistência, e tiveram uma duração de 6 dias, durante os
quais, diferentes amostras das culturas foram retiradas em períodos de 24 h, de forma a estimar o número
de células bacterianas ao longo do tempo. Após a contagem de colónias e estimação do número de
células bacterianas ao longo do tempo em cada momento analisado, as cinéticas de morte das diferentes
estirpes analisadas foram calculadas, e o seu decaimento foi estudado matematicamente e ilustrado em
diferentes gráficos.
Os nossos resultados indicam que na primeira fase das curvas de morte, as bactérias E. coli K12 com
mutações cromossómicas conferentes de resistência a apenas um antibiótico (ácido nalidíxico ou
rifampicina) decaem mais rápido do que o controlo (que não possui resistência a algum antibiótico),
enquanto que as bactérias com mutações cromossómicas conferentes de resistência a ambos os
antibióticos apresentam uma taxa de sobrevivência maior nas primeiras horas de decaimento. Contudo,
as subpopulações de células persistentes destas bactérias apresentaram taxas de decaimento semelhantes
às do controlo, não revelando nenhum impacto destas mutações na segunda fase das curvas de morte
destas estirpes. Para além disto, neste estudo também observámos que a subpopulação de células
persistentes de E. coli portadoras do plasmídeo R702 ou do plasmídeo RN3 apresentaram uma taxa de
decaimento maior ou reduzida em comparação com o controlo, respetivamente. Contudo, nenhum destes
plasmídeos teve um impacto significativo na primeira fase de morte destas bactérias, tendo esta sido
idêntica à da estirpe controlo.
Com o objetivo de avaliar se a taxa de crescimento das bactérias estudadas se encontrava
correlacionada com as suas respetivas taxas de decaimento, medimos as curvas de crescimento de todas
as estirpes analisadas. Para isto, foi utilizado um leitor de microbiologia (Bioscreen), que nos permitiu
acompanhar o crescimento das diferentes bactérias, ao medir a absorbância a OD600 nm de 10 min em
10 min durante um período de 24 h. Uma vez que a maioria dos antibióticos apenas consegue matar
células em crescimento, as bactérias com menores taxas de crescimento deveriam apresentar também
menores taxas de decaimento. Contudo, após calcular as taxas de crescimento das diferentes estirpes
analisadas, observámos que as diferenças nas taxas de crescimento não conseguiam explicar as
diferenças observadas no decaimento destas estirpes. Ao analisar as estirpes com menores taxas de
crescimento, observámos que algumas destas não seguem esta hipótese, nomeadamente as que possuem
mutações cromossómicas que conferem resistência à rifampicina e aquelas que contém o plasmídeo
R702 (e possuem ou não resistências cromossómicas), uma vez que numa determinada fase das suas
curvas de morte, estas decaem mais rapidamente do que a estirpe controlo. Para além disto, esta hipótese
não conseguiu explicar outros resultados (como o decaimento mais rápido na primeira fase da curva de
morte da estirpe que possui mutações cromossómicas e carrega o plasmídeo RN3, ou as taxas de decaimento na segunda fase, semelhantes ao controlo, das estirpes com mutações cromossómicas que
conferem resistência ao acido nalidíxico e/ou à rifampicina). Portanto, suspeitamos que outras causas
(como a epistasia genética) possam explicar esses resultados. Sendo que, após o estudo matemático dos
decaimentos das diferentes populações bacterianas, os nossos resultados evidenciavam uma ligeira
tendência que favorecia a distribuição exponencial em detrimento da distribuição de lei de potência,
indicando possivelmente um mecanismo genético para a persistência. Contudo, estes resultados não são
suficientes para definir adequadamente qual distribuição (exponencial ou lei de potência) melhor se
adequa ao decaimento das subpopulações de persistentes, sendo necessária a realização de mais
experiências com este objetivo.
Bacterial persistence is a state of dormancy in which a subpopulation of bacterial cells with low metabolic activity and growth rates are capable to survive to temporary exposition to antibiotics. In contrast, antibiotic resistance is the ability of a bacterial population not only to survive but also to replicate in the presence of an antibiotic. While antibiotic resistance is widely recognised as the main cause of antibiotic treatments failure, persistence has emerged in recent years as a significant contributor to the recurrence of bacterial infections, posing a severe threat to human health. To investigate whether resistance to different antibiotics, conferred whether by chromosomal point mutations or plasmids can affect the decay of bacterial populations (including their subpopulation of persisters), we measured the decay of such bacteria under exposition to ampicillin. Additionally, as the decay of persister cells populations can follow an exponential or power-law distribution, we mathematically analysed the decay patterns of these populations. Our results revealed that, Escherichia coli K12 spontaneous mutants resistant to only one antibiotic (nalidixic acid or rifampicin) initially decay faster than expected. In contrast, the double resistant mutant exhibited greatersurvival during the early stages of decay compared to the control strain (lacking resistance determinants). Furthermore, we observed distinct decay rates among persister subpopulations: E. coli carrying the R702 plasmid shown an increased decay rate, while those with the RN3 plasmid demonstrated a reduced decay rate. These variations in the bacterial population decay could not be attributed solely to the differences in growth rates of the respective bacterial strains, suggesting that other factors, such as gene epistasis may play a role. Finally, our results were inconclusive in determining whether an exponential or power-law distribution better fits the decay patterns of persister populations.
Bacterial persistence is a state of dormancy in which a subpopulation of bacterial cells with low metabolic activity and growth rates are capable to survive to temporary exposition to antibiotics. In contrast, antibiotic resistance is the ability of a bacterial population not only to survive but also to replicate in the presence of an antibiotic. While antibiotic resistance is widely recognised as the main cause of antibiotic treatments failure, persistence has emerged in recent years as a significant contributor to the recurrence of bacterial infections, posing a severe threat to human health. To investigate whether resistance to different antibiotics, conferred whether by chromosomal point mutations or plasmids can affect the decay of bacterial populations (including their subpopulation of persisters), we measured the decay of such bacteria under exposition to ampicillin. Additionally, as the decay of persister cells populations can follow an exponential or power-law distribution, we mathematically analysed the decay patterns of these populations. Our results revealed that, Escherichia coli K12 spontaneous mutants resistant to only one antibiotic (nalidixic acid or rifampicin) initially decay faster than expected. In contrast, the double resistant mutant exhibited greatersurvival during the early stages of decay compared to the control strain (lacking resistance determinants). Furthermore, we observed distinct decay rates among persister subpopulations: E. coli carrying the R702 plasmid shown an increased decay rate, while those with the RN3 plasmid demonstrated a reduced decay rate. These variations in the bacterial population decay could not be attributed solely to the differences in growth rates of the respective bacterial strains, suggesting that other factors, such as gene epistasis may play a role. Finally, our results were inconclusive in determining whether an exponential or power-law distribution better fits the decay patterns of persister populations.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Persistência Resistência Antibióticos Plasmídeos Bactérias Teses de mestrado - 2025