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Publicação
Papel dos esfingolípidos complexos na organização da membrana plasmática da levedura Saccharomyces cerevisiae
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Resumo(s)
Na levedura Saccharomyces cerevisiae observa-se um aumento da resistência a antibióticos poliénicos, como a nistatina, nas células em que não há formação do esfingolípido manosildi-fosfato de inositol-ceramida, M(IP)2C, (ipt1Δ). Assim, com o objetivo de avaliar se a ausência de M(IP)2C induz alterações na organização da membrana, realizaram-se estudos biofísicos recorrendo tanto a células intactas como a extratos lipídicos de células wild type (wt) e ipt1Δ, utilizando técnicas de fluorescência e microscopia de força atómica (AFM). Foi feita uma otimização da extração dos lípidos totais celulares com o intuito de obter um maior rendimento de extração e posteriormente proceder à purificação dos esfingolípidos complexos.
A caraterização biofísica da membrana plasmática em células vivas através do decaimento de intensidade de fluorescência do ácido trans-parinárico revelou que a ausência de M(IP)2C não altera a rigidez dos domínios gel, indicando que este esfingolípido não deverá ser um componente importante daqueles domínios. Contudo, a anisotropia de fluorescência do difenil-hexatrieno mostra que a membrana é, globalmente, mais ordenada na ausência deste esfingolípido. Estes resultados sugerem que outros esfingolípidos complexos, que em células wt se encontram maioritariamente em domínios gel, estejam mais uniformemente distribuídos pelas membranas em células ipt1Δ e/ou que o ergosterol, possa também estar distribuído na célula de forma diferente.
Os lipossomas preparados a partir dos extratos lipídicos obtidos provenientes de células wt por um método que favorece a extração de glicerofosfolípidos relativamente a esfingolípidos apresentam-se mais ordenados e imagens de AFM sugerem uma maior fração de domínios ordenados, e, eventualmente, uma maior espessura de domínios desordenados, do que em extratos lipídicos de células ipt1Δ.
Globalmente, os resultados obtidos sugerem que, na membrana plasmática, o M(IP)2C pode favorecer a tendência da membrana aumentar a abundância de domínios gel, e ainda influenciar as propriedades dos restantes domínios da membrana plasmática (líquido ordenado e líquido desordenado).
In Saccharomyces cerevisiae, cells that do not synthesize mannosyl-diinositolphosphorylceramide, M(IP)2C, (ipt1), exhibit higher resistance towards polyene antibiotics, such as nystatin. Thus, in order to evaluate whether the absence of M(IP)2C changes membrane organization, fluorescence spectroscopy and atomic force microscopy (AFM) studies carried out with intact cells or lipid extracts from wild type (wt) and ipt1Δ strains were performed. Total lipid extraction from both strains was optimized to increase extraction yield and in the future purify complex sphingolipids. The biophysical characterization of the plasma membrane of intact cells through time-resolved trans-parinaric acid fluorescence intensity showed that the absence of M(IP)2C does not affect the rigidity of gel domains, suggesting that this sphingolipid should not be a major component of those domains. However, fluorescence anisotropy of diphenylhexatriene reveals that the plasma membrane exhibits a higher global order in the absence of this sphingolipid, indicating that other complex sphingolipids which in wt are mainly involved in the formation of gel domains might be dispersed throughout the membrane of ipt1 and/or that the ergosterol might also have a different cellular distribution in the absence of this complex sphingolipid. Liposomes prepared from lipid extracts of wt cells (which contain M(IP)2C) obtained by a method that favors the extraction of glycerophospholipids as compared to sphingolipids show a higher degree of order over a large range of temperatures. In addition, AFM results suggest a larger fraction of ordered domains and, eventually, a larger thickness of the disordered domains. Globally, the results obtained in this work suggest that M(IP)2C may positively affect the ability of the membrane to increase the abundance of gel domains, and it also modulates the properties of the remaining membrane domains (liquid disordered and liquid ordered).
In Saccharomyces cerevisiae, cells that do not synthesize mannosyl-diinositolphosphorylceramide, M(IP)2C, (ipt1), exhibit higher resistance towards polyene antibiotics, such as nystatin. Thus, in order to evaluate whether the absence of M(IP)2C changes membrane organization, fluorescence spectroscopy and atomic force microscopy (AFM) studies carried out with intact cells or lipid extracts from wild type (wt) and ipt1Δ strains were performed. Total lipid extraction from both strains was optimized to increase extraction yield and in the future purify complex sphingolipids. The biophysical characterization of the plasma membrane of intact cells through time-resolved trans-parinaric acid fluorescence intensity showed that the absence of M(IP)2C does not affect the rigidity of gel domains, suggesting that this sphingolipid should not be a major component of those domains. However, fluorescence anisotropy of diphenylhexatriene reveals that the plasma membrane exhibits a higher global order in the absence of this sphingolipid, indicating that other complex sphingolipids which in wt are mainly involved in the formation of gel domains might be dispersed throughout the membrane of ipt1 and/or that the ergosterol might also have a different cellular distribution in the absence of this complex sphingolipid. Liposomes prepared from lipid extracts of wt cells (which contain M(IP)2C) obtained by a method that favors the extraction of glycerophospholipids as compared to sphingolipids show a higher degree of order over a large range of temperatures. In addition, AFM results suggest a larger fraction of ordered domains and, eventually, a larger thickness of the disordered domains. Globally, the results obtained in this work suggest that M(IP)2C may positively affect the ability of the membrane to increase the abundance of gel domains, and it also modulates the properties of the remaining membrane domains (liquid disordered and liquid ordered).
Descrição
Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013
Palavras-chave
Manosildi-fosfato de inositol-ceramida Espetroscopia de fluorescência Domínios de esfingolípidos Extratos lipídicos Biofísica de membranas Teses de mestrado - 2013