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Publicação
Exploiting natural and artificial diversity of plasma membrane efflux pumps towards improved cell factories for biorefineries
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
The industrialization, growth of global population and emergence of consumerism-based lifestyles led
to an unsustainable global energy demand. Consequently, there is the need for environmentallyfriendly solutions for the production of energy and chemicals, such as biorefineries. One example is
the use of yeasts to catalyze the production of ethanol from lignocellulosic feedstocks, obtained from
non-food crops and wastes from agroforestry activities. However, this process requires the hydrolysis
of the lignocellulosic material for the release of fermentable sugars, which results in the formation of
compounds that inhibit yeast metabolism and limit the process yield. Inhibitor tolerance is thus a
desirable trait in cell factories, which has motivated extensive research on the mechanisms of yeast
stress tolerance and the search for superior gene variants for the rational engineering of robustness.
In the present work, a set of Multidrug/Multixenobiotic Resistance (MDR/MXR) transporters was
screened for a role in S. cerevisiae tolerance to stress induced by acetic and formic acids, furfural and
5-hydroxymethylfurfural (HMF), commonly found in lignocellulosic hydrolysates. The Major
Facilitator Superfamily (MFS) transporters Tpo2 and Tpo3, and the ABC transporter Pdr18 were
identified as reducing the latency phase during cultivation of unadapted yeast populations in the
presence of weak acid and/or furfural stress. Artificial TPO3 gene variants were generated by errorprone PCR and tested for improved tolerance to acetic acid. Of the 294 clones tested, 2 were found to
exhibit a slightly higher maximum specific growth rate in the presence of acetic acid, when compared
to the corresponding parental strain, and were sequenced for identification of putative causal
mutations. Finally, the natural variability of the TPO3 gene sequence was investigated among 1011 S.
cerevisiae strains from different environments. Several strains harboring different TPO3 natural
variants were preliminarily screened for their tolerance to acetic acid.
A revolução industrial resultou num grande desenvolvimento económico, e num aumento significativo da qualidade e esperança média de vida. No entanto, levou também a um aumento exponencial da população mundial, ao surgimento de estilos de vida baseados no consumismo, à utilização intensiva de combustíveis fósseis e, consequentemente, a requisitos energéticos insustentáveis à escala global, com drásticas consequências para o meio ambiente. Assim, tornou-se necessário desenvolver formas de obtenção de energia mais sustentáveis, como é o caso da energia produzida em biorefinarias. De forma geral, o conceito de biorefinaria refere-se a centrais onde se procede à decomposição sustentável de matéria orgânica variada, visando a produção de biocombustíveis e de outros compostos químicos de interesse económico, como por exemplo as resinas. Desta forma, as biorefinarias são uma aposta para o combate à utilização de energias fósseis de forma a reduzir a libertação de gases com efeito estufa e a impedir o agravamento da preocupante situação ambiental em que o planeta se encontra. De entre os tipos de matérias-primas utilizadas em biorefinarias, o material lenho-celulósico é dos que potenciam um melhor aproveitamento dos recursos, englobando-se nas políticas de economia circular. Estas matérias orgânicas são ricas em polímeros de açúcares (hemicelulose e celulose) e em lenhina e, idealmente, são obtidas de culturas de plantas que não competem com a alimentação humana ou animal, proveniente de atividades de limpeza florestal e do aproveitamento de resíduos agrícolas. Para que microrganismos como a levedura Saccharomyces cerevisiae possam catalisar a produção de bioetanol através da fermentação de açúcares presentes em biomassa lenho-celulósica, é fundamental implementar processos de degradação da matriz orgânica de forma a libertar os monossacáridos. Não obstante, as várias etapas do tratamento conduzem à produção de variados compostos com ação inibitória no metabolismo das leveduras, nomeadamente ácido acético, ácido fórmico, furfural e 5- hidroximetilfurfural (HMF), que causam inibição de crescimento e consequentemente perda de eficiência na produção de etanol e outros compostos. Posto isto, torna-se crucial perceber o processo inibitório dos compostos formados e especialmente investigar e melhorar os mecanismos implementados pelos microrganismos que lhes conferem uma maior resistência a inibidores presentes em hidrolisados lenho-celulósicos e, consequentemente, uma maior robustez enquanto fábrica celular microbiana. Ao longo de milénios de evolução, os seres vivos e especialmente os seres unicelulares desenvolveram mecanismos que lhes permitem sobreviver, evitar e ultrapassar os danos adventícios da exposição a agentes tóxicos. O presente trabalho focou-se no estudo de transportadores de membrana plasmática envolvidos na resistência de S. cerevisiae a múltiplas drogas/xenobióticos (MDR/MXR), dado o extensivo estudo de que esta levedura tem sido alvo, a sua grande aplicabilidade em inúmeras áreas biotecnológicas, e tendo em conta a grande quantidade de fenótipos de resistência que têm vindo a ser associados com transportadores MDR/MXR. Neste âmbito, este projeto teve como objetivos a identificação de transportadores MDR/MXR que têm um papel na resistência de S. cerevisiae a inibidores gerados no tratamento de matéria-prima lenho-celulósica e de variantes genéticas desses transportadores, geradas artificialmente ou existentes em estirpes isoladas de vários ambientes da natureza, que resultem numa maior resistência aos referidos inibidores. O objetivo final seria a aplicação dessas variantes genéticas em estipes industriais de S. cerevisiae, aumentando a sua resistência e, simultaneamente, a sua produtividade em processos de biorefinarias. Desta forma, foi avaliado o crescimento de sete mutantes de eliminação para genes que codificam para transportadores MDR/MXR na presença de ácido acético, ácido fórmico, furfural ou HMF, por comparação com o comportamento da estirpe parental (BY4741). Os resultados obtidos neste estudo levaram a que os transportadores MDR/MXR Pdr18, Tpo3 e Tpo2 fossem selecionados para dar seguimento ao projeto, pela sua importância na resistência a ácido acético, ácido fórmico e/ou a furfural. A caracterização das curvas de crescimento dos vários mutantes de eliminação, quando expostos aos diversos inibidores, permitiu verificar que nenhum destes transportadores é importante na tolerância de S. cerevisiae ao stress induzido pela presença de HMF, enquanto que em presença de furfural os mutantes tpo2Δ e tpo3Δ apresentavam um maior período de adaptação. Na presença de ácido acético, a eliminação dos transportadores Pdr18, Tpo2 e Tpo3 mostrou ser prejudicial e, em presença de ácido fórmico, apenas o mutante pdr18Δ mostrou ser mais suscetível do que a estirpe parental. Complementarmente, foi testado o papel dos transportadores Tpo2, Tpo3 e Pdr18 no crescimento de células adaptadas e/ou não adaptadas em presença de suplementação do meio com uma concentração sub-letal de ácido acético. Observou-se que o papel destes transportadores reside maioritariamente na redução do tempo de adaptação em células não previamente adaptadas. Após seleção dos transportadores de interesse, foi feita uma amplificação dos genes PDR18, TPO2 e TPO3 usando uma polimerase propensa a erro, de forma a gerar formas alternativas destes genes. Os fragmentos mutados foram clonados num plasmídeo e transformados em células do respetivo mutante de eliminação. As estipes obtidas, que expressavam variantes artificiais de TPO3, foram cultivadas na presença de ácido acético e procurou-se identificar aquelas em que, não só houvesse uma recuperação do fenótipo de suscetibilidade exibido pelos mutantes de eliminação tpo3Δ, mas também um aumento de tolerância em relação ao mutante de eliminação complementado com o gene TPO3 de BY4741. Das 294 estirpes obtidas, 2 foram identificadas como apresentando uma ligeira melhoria de tolerância à concentração de ácido acético testada, quando comparado com a respetiva estirpe parental. O gene TPO3 codificado no DNA plasmídico destas estirpes foi sequenciado, culminando na identificação e análise de impacto na expressão e/ou estrutura da proteína, de oito mutações causais putativas, localizadas tanto na região codificante do gene, como nas respetivas regiões regulatórias a jusante e a montante. Adicionalmente, foi feita uma análise bioinformática da variabilidade natural da região codificante do gene TPO3 de 1011 estirpes de S. cerevisiae. O estudo bioinformático incluiu a construção de um dendrograma representativo das semelhanças da região codificante do gene TPO3 nas várias estirpes e a compilação e caracterização de uma lista de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) encontrados. Os impactos dos vários SNPs identificados na proteína Tpo3 foram estimados, tendo por base o uso de plataformas online de análise de proteínas. Neste âmbito foi também testado o crescimento de 12 das 1011 estirpes na presença de ácido acético. Este trabalho resultou na identificação de vários SNPs cujo impacto na resistência virá a ser explorado experimentalmente em estudos futuros. Da mesma forma, este trabalho permitiu a identificação de estirpes de S. cerevisiae com elevada tolerância a ácido acético que podem conter ferramentas genéticas a serem exploradas no futuro para guiar a construção de estirpes industriais mais robustas. Em suma, os resultados obtidos no decorrer deste projeto e aqui apresentados contribuíram para o objetivo geral de identificação de variantes genéticas de transportadores MDR/MXR que resultem numa maior tolerância de S. cerevisiae face aos mais comuns inibidores resultantes do pré-tratamento de matéria orgânica lenho-celulósica. Nesse âmbito, este projeto resultou na identificação de oito mutações no gene TPO3 que podem ser determinantes para a tolerância a ácido acético. De forma semelhante, a procura de variantes naturais do gene TPO3 em estirpes de S. cerevisiae isoladas de uma gama diversificada de ambientes e a avaliação do crescimento de algumas dessas estirpes na presença de ácido acético resultou na identificação de algumas variantes genéticas e algumas estirpes que poderão constituir ferramentas genéticas para melhoramento genético de estirpes industriais de S. cerevisiae.
A revolução industrial resultou num grande desenvolvimento económico, e num aumento significativo da qualidade e esperança média de vida. No entanto, levou também a um aumento exponencial da população mundial, ao surgimento de estilos de vida baseados no consumismo, à utilização intensiva de combustíveis fósseis e, consequentemente, a requisitos energéticos insustentáveis à escala global, com drásticas consequências para o meio ambiente. Assim, tornou-se necessário desenvolver formas de obtenção de energia mais sustentáveis, como é o caso da energia produzida em biorefinarias. De forma geral, o conceito de biorefinaria refere-se a centrais onde se procede à decomposição sustentável de matéria orgânica variada, visando a produção de biocombustíveis e de outros compostos químicos de interesse económico, como por exemplo as resinas. Desta forma, as biorefinarias são uma aposta para o combate à utilização de energias fósseis de forma a reduzir a libertação de gases com efeito estufa e a impedir o agravamento da preocupante situação ambiental em que o planeta se encontra. De entre os tipos de matérias-primas utilizadas em biorefinarias, o material lenho-celulósico é dos que potenciam um melhor aproveitamento dos recursos, englobando-se nas políticas de economia circular. Estas matérias orgânicas são ricas em polímeros de açúcares (hemicelulose e celulose) e em lenhina e, idealmente, são obtidas de culturas de plantas que não competem com a alimentação humana ou animal, proveniente de atividades de limpeza florestal e do aproveitamento de resíduos agrícolas. Para que microrganismos como a levedura Saccharomyces cerevisiae possam catalisar a produção de bioetanol através da fermentação de açúcares presentes em biomassa lenho-celulósica, é fundamental implementar processos de degradação da matriz orgânica de forma a libertar os monossacáridos. Não obstante, as várias etapas do tratamento conduzem à produção de variados compostos com ação inibitória no metabolismo das leveduras, nomeadamente ácido acético, ácido fórmico, furfural e 5- hidroximetilfurfural (HMF), que causam inibição de crescimento e consequentemente perda de eficiência na produção de etanol e outros compostos. Posto isto, torna-se crucial perceber o processo inibitório dos compostos formados e especialmente investigar e melhorar os mecanismos implementados pelos microrganismos que lhes conferem uma maior resistência a inibidores presentes em hidrolisados lenho-celulósicos e, consequentemente, uma maior robustez enquanto fábrica celular microbiana. Ao longo de milénios de evolução, os seres vivos e especialmente os seres unicelulares desenvolveram mecanismos que lhes permitem sobreviver, evitar e ultrapassar os danos adventícios da exposição a agentes tóxicos. O presente trabalho focou-se no estudo de transportadores de membrana plasmática envolvidos na resistência de S. cerevisiae a múltiplas drogas/xenobióticos (MDR/MXR), dado o extensivo estudo de que esta levedura tem sido alvo, a sua grande aplicabilidade em inúmeras áreas biotecnológicas, e tendo em conta a grande quantidade de fenótipos de resistência que têm vindo a ser associados com transportadores MDR/MXR. Neste âmbito, este projeto teve como objetivos a identificação de transportadores MDR/MXR que têm um papel na resistência de S. cerevisiae a inibidores gerados no tratamento de matéria-prima lenho-celulósica e de variantes genéticas desses transportadores, geradas artificialmente ou existentes em estirpes isoladas de vários ambientes da natureza, que resultem numa maior resistência aos referidos inibidores. O objetivo final seria a aplicação dessas variantes genéticas em estipes industriais de S. cerevisiae, aumentando a sua resistência e, simultaneamente, a sua produtividade em processos de biorefinarias. Desta forma, foi avaliado o crescimento de sete mutantes de eliminação para genes que codificam para transportadores MDR/MXR na presença de ácido acético, ácido fórmico, furfural ou HMF, por comparação com o comportamento da estirpe parental (BY4741). Os resultados obtidos neste estudo levaram a que os transportadores MDR/MXR Pdr18, Tpo3 e Tpo2 fossem selecionados para dar seguimento ao projeto, pela sua importância na resistência a ácido acético, ácido fórmico e/ou a furfural. A caracterização das curvas de crescimento dos vários mutantes de eliminação, quando expostos aos diversos inibidores, permitiu verificar que nenhum destes transportadores é importante na tolerância de S. cerevisiae ao stress induzido pela presença de HMF, enquanto que em presença de furfural os mutantes tpo2Δ e tpo3Δ apresentavam um maior período de adaptação. Na presença de ácido acético, a eliminação dos transportadores Pdr18, Tpo2 e Tpo3 mostrou ser prejudicial e, em presença de ácido fórmico, apenas o mutante pdr18Δ mostrou ser mais suscetível do que a estirpe parental. Complementarmente, foi testado o papel dos transportadores Tpo2, Tpo3 e Pdr18 no crescimento de células adaptadas e/ou não adaptadas em presença de suplementação do meio com uma concentração sub-letal de ácido acético. Observou-se que o papel destes transportadores reside maioritariamente na redução do tempo de adaptação em células não previamente adaptadas. Após seleção dos transportadores de interesse, foi feita uma amplificação dos genes PDR18, TPO2 e TPO3 usando uma polimerase propensa a erro, de forma a gerar formas alternativas destes genes. Os fragmentos mutados foram clonados num plasmídeo e transformados em células do respetivo mutante de eliminação. As estipes obtidas, que expressavam variantes artificiais de TPO3, foram cultivadas na presença de ácido acético e procurou-se identificar aquelas em que, não só houvesse uma recuperação do fenótipo de suscetibilidade exibido pelos mutantes de eliminação tpo3Δ, mas também um aumento de tolerância em relação ao mutante de eliminação complementado com o gene TPO3 de BY4741. Das 294 estirpes obtidas, 2 foram identificadas como apresentando uma ligeira melhoria de tolerância à concentração de ácido acético testada, quando comparado com a respetiva estirpe parental. O gene TPO3 codificado no DNA plasmídico destas estirpes foi sequenciado, culminando na identificação e análise de impacto na expressão e/ou estrutura da proteína, de oito mutações causais putativas, localizadas tanto na região codificante do gene, como nas respetivas regiões regulatórias a jusante e a montante. Adicionalmente, foi feita uma análise bioinformática da variabilidade natural da região codificante do gene TPO3 de 1011 estirpes de S. cerevisiae. O estudo bioinformático incluiu a construção de um dendrograma representativo das semelhanças da região codificante do gene TPO3 nas várias estirpes e a compilação e caracterização de uma lista de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) encontrados. Os impactos dos vários SNPs identificados na proteína Tpo3 foram estimados, tendo por base o uso de plataformas online de análise de proteínas. Neste âmbito foi também testado o crescimento de 12 das 1011 estirpes na presença de ácido acético. Este trabalho resultou na identificação de vários SNPs cujo impacto na resistência virá a ser explorado experimentalmente em estudos futuros. Da mesma forma, este trabalho permitiu a identificação de estirpes de S. cerevisiae com elevada tolerância a ácido acético que podem conter ferramentas genéticas a serem exploradas no futuro para guiar a construção de estirpes industriais mais robustas. Em suma, os resultados obtidos no decorrer deste projeto e aqui apresentados contribuíram para o objetivo geral de identificação de variantes genéticas de transportadores MDR/MXR que resultem numa maior tolerância de S. cerevisiae face aos mais comuns inibidores resultantes do pré-tratamento de matéria orgânica lenho-celulósica. Nesse âmbito, este projeto resultou na identificação de oito mutações no gene TPO3 que podem ser determinantes para a tolerância a ácido acético. De forma semelhante, a procura de variantes naturais do gene TPO3 em estirpes de S. cerevisiae isoladas de uma gama diversificada de ambientes e a avaliação do crescimento de algumas dessas estirpes na presença de ácido acético resultou na identificação de algumas variantes genéticas e algumas estirpes que poderão constituir ferramentas genéticas para melhoramento genético de estirpes industriais de S. cerevisiae.
Descrição
Tese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Saccharomyces cerevisiae Inibidores derivados de lenho-celulose Transportadores MDR/MXR Ácidos fracos Variantes genéticas Teses de mestrado - 2023